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: 365-370&&&&DOI: 10.3969/j.issn.14.03.006
组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials
掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化
彭& 红，顾志鹏，黄程程，徐源廷，余喜讯
四川大学高分子科学与工程学院，四川省成都市& 610065
Effects of strontium-doped calcium polyphosphate on behavior and angiogenic growth factors expression of co-cultured osteoblasts and endothelial cells
Peng Hong, Gu Zhi-peng, Huang Cheng-cheng, Xu Yuan-ting, Yu Xi-xun
School of Polymer Science and Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China
参考文献(0)
骨组织工程的目标是用来修复大面积骨骼缺损。骨修复过程不仅是新骨的生长，还需要血循环重建，这样才能为新生骨组织中的细胞提供养分，排泄废物[1-2] ，所以理想的骨组织工程支架材料应该具有促血管化功能。在早期骨折愈合过程中会出现缺损局部高能代谢状态，此时对血供及能量物质的需求提高[3-5] ，因此在构建组织工程化骨组织的同时，促进小血管的长入及细胞与材料复合物内血供的重建就成为骨组织工程由基础向临床应用的关键性环节[6] 。血管生成主要受到血管化生长因子的影响。在所有己知的血管化生成因子成员中，血管内皮生长因子是促血管生成作用最为特异而确切的因子，其在生理和病理性血管生成中都起着核心的调节作用[7] 。碱性成纤维细胞生长因子在促血管生成过程中具有多效性特点，它是一种内源性多肽生长因子，同时是另一种最有效的促进血管生成因子，它通过提高成骨细胞的增殖和促进内皮细胞的生长来促进骨形成和血管化[8] 。成骨细胞和内皮细胞在生长良好的状态下都可以表达血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。
然而，在新骨生长过程中诱导快速血管化的困难性成为骨组织工程应用于坏损组织更换的主要限制因素[9-10] 。Pacicca等[11]研究发现成骨细胞与内皮细胞共培养，成骨细胞分泌的血管内皮生长因子量显著高于单一细胞组，同时有血管样结构形成。Hofmann等[12-13]发现成骨细胞与内皮细胞共培养于支架材料上能够生成血管样结构。共培养的成骨和内皮细胞之间通过复杂的相互作用控制着骨形成和血管化[14] ，将两种细胞在支架材料上共培养是解决骨组织工程促血管化的一种有效途径。另一方面，支架材料在骨组织工程的血管化方面也起着重要作用。如果生物材料或组织工程支架材料自身具有诱导血管生成的生物活性，就可以刺激移植或迁移到支架材料上的细胞释放血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，然后与成骨细胞和内皮细胞的共培养体系相结合，将会增加在新骨生长过程中诱导快速血管化的可能性。
锶是一种具有促进骨形成和减少骨吸收双重作用的骨组成元素[15-17] ，同时锶元素能有效提高材料的生物相容性和生物活性。聚磷酸钙是一种具有优良机械性能和生物相容性的生物陶瓷骨组织工程材料，在骨修复方面受到广泛关注[18-19] 。
前期实验发现掺锶聚磷酸钙材料对于单独培养的内皮细胞和成骨细胞的行为有显著促进作用[20-21] 。实验在3种不同支架材料掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石上将成骨细胞与内皮细胞以一定比例共培养，研究掺锶聚磷酸钙支架材料对共培养体系的细胞行为和血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子表达的影响及机制。
杂志出版内容重点：；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；
全文链接：
设计：体外细胞学观察实验。
时间及地点：于2011年7月至2012年7月在四川大学完成。
细胞株：人脐静脉内皮细胞株HUVEC，由四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室提供；人成骨肉瘤MG63细胞株，由四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室提供。
实验方法：
支架材料的制备：按锶/钙一定摩尔比例称取碳酸锶、碳酸钙，与磷酸溶液反应制备磷酸二氢盐，无水乙醇除去多余磷酸。置混合盐于坩埚内，500 ℃煅烧，升温使熔融，再淬火得到无定型烧料。研磨筛分烧料，取粉末与一定量的致孔剂和黏合剂混合，压制成直径10 mm，高2 mm的型胚，一定温度下烧结制得聚磷酸钙和含锶量为8%的掺锶聚磷酸钙多孔支架，&射线辐照灭菌后备用。
内皮细胞和成骨样细胞的培养：将冻存的内皮细胞HUVECs和人成骨肉瘤MG63细胞复苏，用含体积分数为10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI1640培养液于37 ℃、体积分数为5%CO2的饱和湿度下培养，隔天换液。取第3代细胞备用。
细胞与支架材料的复合培养：在接种细胞前，将&射线辐照灭菌后的掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支架材料在RPMI-1640培养液中浸泡12 h，其中羟基磷灰石和聚磷酸钙作为实验对照。将第3代两种细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液。将两种种子细胞与8%掺锶聚磷酸钙(聚磷酸钙或羟基磷灰石)复合培养于24孔板中，每孔细胞数相同。人成骨肉瘤MG63细胞接种浓度为0.3&108 L-1，200 &L/孔；人脐静脉内皮细胞HUVEC接种浓度为0.3&108 L-1，&100 &L/孔，即人成骨肉瘤MG63和人脐静脉内皮细胞HUVEC直接共培养比例为2∶1。选用2∶1的比例是因为成骨细胞与内皮细胞以2∶1共培养时两种细胞有更好的相容性，碱性磷酸酶等有更好的活性[22-23]。
共培养体系细胞形态的扫描电镜观察：细胞在掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支架材料上培养7 d后，取出材料，PBS洗涤后，3%戊二醛固定，4 ℃过夜，经体积分数为30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%的乙醇梯度脱水(每个体积分数乙醇脱水2次，15 min/次)，乙酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，表面喷金后作扫描电镜观察，实验步骤由四川大学分析测试中心扫描电镜室协助完成。
细胞增殖实验：将细胞支架复合物培养14 d，分别在1，3，7，10，14 d行MTT法检测细胞活性，即加入MTT溶液60 &L/孔，继续培养4 h，小心吸弃上清，加入二甲基亚砜&& 150 &L/孔。振荡10 min，在酶标仪上492 nm波长下测定各孔吸光度值，得出各组细胞的增殖情况，并绘制生长曲线。
ELISA检测支架材料上细胞血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的分泌：细胞分别与掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支架材料复合培养7 d，至细胞汇合后，离心取上清液，按照R&D公司的ELISA试剂盒说明进行血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的测定。
主要观察指标： ①两种细胞与不同支架共培养后的细胞形态。②两种细胞与不同支架共培养后的增殖及细胞因子的分泌。
统计学分析：由第一作者采用SPSS13.0进行统计学处理，数据用x(_)&s表示，运用单因素方差分析进行检验，P & 0.05为差异有显著性意义。
杂志出版内容重点：；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；
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两种细胞与支架材料复合培养的增殖实验说明锶能有效促进共培养体系细胞的增殖。同时结合扫描电镜观察细胞在材料上的生长形态，发现掺锶聚磷酸钙具有良好的材料表面、细胞界面，有利于细胞的黏附和铺展，进而促进细胞的增殖。
ELISA实验结果表明掺锶聚磷酸钙明显上调了血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的蛋白表达，与增殖实验结果一致。材料的血管化需要生长因子的参与。血管内皮生长因子通过诱导内皮细胞增生，促进血管的形成，同时还通过促血管形成参与骨的发育；作为旁分泌因子参与骨形成与代谢[24-25] 。碱性成纤维细胞生长因子可以自分泌和旁分泌两种方式促进自身细胞与周围细胞的增殖、分化、蛋白质合成等生物学行为。实验结果表明，掺锶聚磷酸钙可作为一种潜在的具有促血管化作用的材料使用，这为在骨组织工程上解决血管化问题提供了一种新思路。
掺锶聚磷酸钙中释放出的锶能更好地促进细胞在支架材料上的黏附和增殖，进而促进血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的表达。有研究表明，锶是通过激活细胞钙敏感受体，从而激活三磷酸肌醇和促有丝分裂原活化蛋白激酶来实现促进细胞增殖的[26] 。Tokuda等[27]报道碱性成纤维细胞生长因子可以激活成骨细胞内的信号因子p44/p42有丝分裂原活化蛋白激酶来促进成骨细胞血管内皮生长因子的表达，说明锶元素很可能是通过细胞钙敏感受体作用于MAPK来调节血管内皮生长因子表达的。血管内皮生长因子表达受很多细胞因子的影响，如成骨细胞分泌的转化生长因子&能刺激血管内皮生长因子的表达、内皮细胞分泌的成纤维细胞生长因等都能刺激血管内皮生长因子的表达[28] 。有研究表明锶能通过钙通道进入细胞内[29] ，可能通过调节上述因子进而促进血管内皮生长因子的表达。Jaebong等[30]研究发现当成骨细胞受外界刺激后，能迅速表达c-fos基因，然后激活转录蛋白FOS。FOS是在细胞核内起作用的蛋白质，它与其他一些转录因子结合形成活性蛋白1，活性蛋白1再与基因序列中的TRE位点结合，启动这些基因的转录导致一系列生物学效应的产生。碱性成纤维细胞生长因子基因的启动子区就有TRE位点，故活性蛋白1可与之特异性结合，从而启动碱性成纤维细胞生长因子基因的转录，进而产生一系列生物学效应，因此可认为FOS作用于TRE位点是其诱导碱性成纤维细胞生长因子表达的途径之一[31] 。而细胞微环境中的锶可能是诱导c-fos基因表达的外界刺激因素，诱导细胞碱性成纤维细胞生长因子表达。综上，掺锶聚磷酸钙在降解过程中释放的锶可以通过一系列的生物效应促进细胞血管化生长因子的表达。
杂志出版内容重点：；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；
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掺锶聚磷酸钙中释放出的锶能更好地促进细胞在支架材料上的黏附和增殖，进而促进血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的表达。有研究表明，锶是通过激活细胞钙敏感受体，从而激活三磷酸肌醇和促有丝分裂原活化蛋白激酶来实现促进细胞增殖的。Tokuda等报道碱性成纤维细胞生长因子可以激活成骨细胞内的信号因子p44/p42有丝分裂原活化蛋白激酶来促进成骨细胞血管内皮生长因子的表达，说明锶元素很可能是通过细胞钙敏感受体作用于MAPK来调节血管内皮生长因子表达的。血管内皮生长因子表达受很多细胞因子的影响，如成骨细胞分泌的转化生长因子&能刺激血管内皮生长因子的表达、内皮细胞分泌的成纤维细胞生长因等都能刺激血管内皮生长因子的表达。有研究表明锶能通过钙通道进入细胞内，可能通过调节上述因子进而促进血管内皮生长因子的表达。Jaebong等研究发现当成骨细胞受外界刺激后，能迅速表达c-fos基因，然后激活转录蛋白FOS。FOS是在细胞核内起作用的蛋白质，它与其他一些转录因子结合形成活性蛋白1，活性蛋白1再与基因序列中的TRE位点结合，启动这些基因的转录导致一系列生物学效应的产生。碱性成纤维细胞生长因子基因的启动子区就有TRE位点，故活性蛋白1可与之特异性结合，从而启动碱性成纤维细胞生长因子基因的转录，进而产生一系列生物学效应，因此可认为FOS作用于TRE位点是其诱导碱性成纤维细胞生长因子表达的途径之一。而细胞微环境中的锶可能是诱导c-fos基因表达的外界刺激因素，诱导细胞碱性成纤维细胞生长因子表达。综上，掺锶聚磷酸钙在降解过程中释放的锶可以通过一系列的生物效应促进细胞血管化生长因子的表达。
杂志出版内容重点：；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；
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研究亮点: 1 前期实验发现掺锶聚磷酸钙材料对于单独培养的内皮细胞和成骨细胞的行为有显著促进作用。文章的创新在于首次从分子水平探讨掺锶聚磷酸钙对共培养下成骨细胞与脐静脉内皮细胞行为和功能蛋白表达的影响。
2 文章的特点在于首次发现成骨肉瘤细胞与内皮细胞共培养于掺锶聚磷酸钙后，掺锶聚磷酸钙上调了细胞血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白水平的表达。今后将对血管初期成型方面进行进一步研究，使体系更完善。
杂志出版内容重点：；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；
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Abstract：BACKGROUND: Our previous studies have shown that strontium-doped calcium polyphosphate containing low-dose strontium appears to have a significant effect on angiogenesis-related behaviors of monocultured umbilical vein endothelial cells and osteoblasts.
OBJECTIVE: To investigate the effect of strontium-doped calcium polyphosphate on angiogenesis-related behaviors of umbilical vein endothelial cells and osteoblasts co-cultured, including cell adhesion, spreading, proliferation, as well as the protein secretion of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor from co-culture system in vitro.
METHODS: Human umbilical vein endothelial cells and osteoblastic cells (MG63) were utilized in this study. Cells from passage 3 were used for preparation of the cell-scaffold constructs. After placed in 24-well plate at a ratio of 2:1, human umbilical vein endothelial cells and MG63 cells were seeded onto strontium-doped calcium polyphosphate, calcium polyphosphate and hydroxyapatite scaffolds and co-cultured for 7 days. The vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor protein levels were determined through a double ligand enzyme-linked immunosorbent assay. The colorimetric 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide assay was performed to quantify the effect of scaffolds on cell proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with those on calcium polyphosphate and hydroxyapatite scaffolds, cells on strontium-doped calcium polyphosphate scaffolds attached and spread better with a significantly improved cell proliferation. More importantly, the vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor expressions were significantly higher in the strontium-doped calcium polyphosphate group than the other two groups (P & 0.05), indicating strontium-doped calcium polyphosphate can up-regulate levels of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor proteins.
杂志出版内容重点：；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；
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Key words：
中图分类号:&
余喜讯，副教授，四川大学高分子科学与工程学院，四川省成都市
作者简介: 彭红，女，1987年生，湖北省天门市人，汉族，2013年四川大学毕业，硕士，主要从事生物材料研究。
引用本文: &&
红,顾志鹏,黄程程等. 掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化[J]. 中国组织工程研究, ): 365-370.
Peng Hong,Gu Zhi-peng,Huang Cheng-cheng et al. Effects of strontium-doped calcium polyphosphate on behavior and angiogenic growth factors expression of co-cultured osteoblasts and endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, ): 365-370.
2.1&支架材料的多孔结构和表面形貌观察&& 图1为掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支架材料表面形貌的扫描电镜图片。
从低倍图片可以看出，这几种材料呈三维贯通的多孔结构，主要为圆形孔，孔互相之间有联通，且分布均匀，这就为细胞的长入提供了前提条件；支架材料的孔隙度约为65%，孔径大小在100-400 &m范围；与聚磷酸钙和羟基磷灰石相比较，掺锶聚磷酸钙的表面更光滑，晶粒堆积更紧密；从5 000倍的图片看，掺锶聚磷酸钙的晶粒更大且圆滑，晶粒间有较清晰的界限，通过非晶相紧密地连接在一起形成更紧密的表面和体积堆积。掺锶聚磷酸钙中的非晶相可能为聚磷酸锶，由于聚磷酸锶熔点比聚磷酸钙低，而烧结温度介于聚磷酸锶和聚磷酸钙的熔点之间，在此温度下，聚磷酸锶熔融将聚磷酸钙晶粒间缝隙填补，从而形成更紧凑的结构。
2.2&共培养细胞在材料表面生长的扫描电镜观察 &&对于掺锶聚磷酸钙支架材料是否能够维持细胞良好形态的研究是必要的。图2显示了细胞与支架材料复合培养7 d后，细胞在掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石表面的伸展和黏附。
与聚磷酸钙和羟基磷灰石相比，在掺锶聚磷酸钙表面生长的成骨肉瘤细胞和内皮细胞呈现出更加良好的细胞形态，成骨细胞呈典型的纺锤形，内皮细胞呈不规则的菱形，细胞边缘清晰完整，尺寸正常，细胞伪足清晰可见，细胞融合生长形成单层覆盖在材料表面，并且在材料表面有一定的跨度生长(图2F)。
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通过图片可以看到，在细胞培养液中浸泡过的3种支架材料呈现不同的表面形态，掺锶聚磷酸钙的表面比聚磷酸钙和羟基磷灰石更加平滑，这说明掺锶聚磷酸钙能促进内皮细胞在其上黏附、伸展，进而有利于细胞的生长和增殖。可能是由于在细胞培养液中的掺锶聚磷酸钙能维持良好的材料表面，同时降解释放出锶的元素有利于细胞的生长，使细胞更好地黏附和生长。
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2.3&共培养的细胞与支架材料复合培养的生长曲线&&& 图3A为共培养的成骨肉瘤细胞和内皮细胞与3种支架材料复合培养不同时间的细胞增殖情况。随着培养时间的延长，各组细胞增殖都呈上升趋势，峰值出现在第10天，到第14天，由于培养液中细胞分泌物的过多累积，细胞活性整体回落。在14 d的复合培养时间段内，掺锶聚磷酸钙组的细胞数量一直明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组，细胞增殖速率也一直明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组。
另外，聚磷酸钙组细胞增殖速率也一直明显高于羟基磷灰石组。相比于聚磷酸钙和羟基磷灰石，在掺锶聚磷酸钙表面共培养细胞可更好地黏附和生长，可能是因为培养液中同时有释放出的锶元素能进一步刺激促进细胞的生长行为，使得掺锶聚磷酸钙能显著促进细胞的增殖。
2.4 &不同支架材料上细胞血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的蛋白分泌量& & 图3B显示了共培养的成骨细胞和内皮细胞与不同支架材料复合培养7 d后，细胞培养上清液中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子蛋白分泌量的检测情况。
由图可见，掺锶聚磷酸钙组细胞分泌的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组(P & 0.05)。另外，聚磷酸钙组细胞分泌的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子也要高于羟基磷灰石组(P & 0.05)。ELISA实验结果表明掺锶聚磷酸钙明显上调了血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的蛋白表达，原因可能是掺锶聚磷酸钙降解释放出锶元素，同时材料优良的三维结构和表面形貌为细胞生长提供了良好的微环境，有利于细胞功能的表达。
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《中国组织工程研究》杂志社地址：沈阳10002邮政信箱，邮编：1101802013年临床执业医师考试医学免疫学练习试题(6)
第六章 细胞因子一．选择题【A型题】1． 关于细胞因子的共性，下列哪项是错误的？A. 无MHC限制性B. 特异性C. 高效性D. 网络性E. 作用多向性2． 细胞因子不包括：A. 淋巴毒素B. 过敏毒素C. IL-2D. 集落刺激因子E. 干扰素3． 关于IL-2的生物学作用，下列哪项是错误的？A. 以自分泌和旁分泌发挥作用B. 能促进T、B淋巴细胞增殖与分化C. 能增强NK细胞活性D. 抑制Th1细胞的分化E. 能增强巨噬细胞的吞噬杀伤功能4． 主要由单核/巨噬细胞产生的细胞因子是：A. TNF-αB. IFN-γC. IL-2D. IL-3E. IL-45． 直接能杀伤靶细胞的细胞因子有：A. IL-1B. IL-2C. IL-4D. IFN-γE. TNF-α6． IFN-γ主要由下列那种细胞产生？A. 活化的T细胞B. 巨噬细胞C. 树突状细胞D. 成纤维细胞E. B淋巴细胞7． 能增强MHC-I/II类分子表达、促进APC提呈抗原作用的细胞因子是：A. IFN-γB. TGFC. CSFD. IL-1E. IL-28． 促进Th0细胞分化成Th1细胞的主要细胞因子是：A. IL-1， IL-8B. IL-3，GM-SCFC. IL-4，IL-5D. IL-5，IL-6E. IL-12，IFN-γ9． 促进Th0细胞分化成Th2细胞的主要细胞因子是：A. IL-3B. IL-5C. IL-2D. IL-4E. IL-1210．对淋巴细胞和巨噬细胞具有抑制作用的细胞因子是：A. IL-1B. IL-2C. IL-12D. TGF-βE. GM-CSF答案见尾页11．刺激B细胞产生IgG2a的细胞因子是：A. TNFB. IL-4C. IL-2D. TGF-βE. IFN-γ12．下列哪组细胞因子具有趋化作用？A. IL-1，IL-8B. IFN，MCP-1C. IL-8，MCP-1D. TNF，IL-4E. IL-1，IL-613．Th1细胞与Th2细胞之间主要分别通过分泌什么细胞因子而相互抑制？A. IFN-γ，IL-4B. IL-4，IFN-γC. TNF，IL-1D. IL-4，IL-5E. GM-SCF，TNF14．刺激多种造血细胞分化成熟的细胞因子是：A. TNFB. SCFC. ILD. TGFE. IFN15．可用于治疗白细胞减少症的细胞因子是：A. IL-2B. IL-11C. IFN-γD. EPOE. M-CSF16．可刺激NK细胞、增强其杀伤活性的IL是：A. IL-3，IL-5B. IL-2，IFN-γC. EPO，M-CSFD. IL-1，IL-4E. IL-4，IL-717．在Ig类别转换中，能促进IgM转换为IgE和IgG1的细胞因子是：A. IL-1B. IL-2C. IL-4D. IL-6E. TNF18．促进肝细胞产生急性期蛋白的细胞因子是：A. IL-2，IL-3B. IL-1，IL-6C. IL-4，IL-5D. IL-7，IL-10E. IL-8，IL-13答案见尾页【X型题】1. 巨噬细胞的活化因子包括：A. IL-2B. IFN-γC. GM-SCFD. MCPE. IL-102. Th2细胞主要通过分泌哪些细胞因子辅助B细胞的体液免疫应答？A. IL-4B. IL-5C. IL-6D. IL-10E. IL-133. Th1细胞主要通过分泌哪些细胞因子介导细胞免疫应答？A. IL-2B. TNFC. IFN-γD. IL-10E. IL-134. 对NK细胞的活化、分化具有正调节作用的CK是：A. IL-2B. IL-12C. IFN-γD. IL-18E. CSF5. 促炎症细胞因子包括：A. TNFB. IL-1C. IL-8D. IL-6E. IFN-γ二．填空题1．细胞因子按结构和功能可被分为 _____、_____ 、_____ 、_____ 、_____ 等六类。2． I型干扰素主要由 ______、_____ 和_____ 细胞产生，II型干扰素主要由_________ 和________ 细胞产生。3．细胞因子的主要生物学活性包括_____ 、--____ 、______ 、_____ 、_____ 、______ 。4． 细胞因子通常以__________ 或_____ 形式作用于邻近细胞或细胞因子产生细胞本身，也可通过_____ 方式作用于远处的细胞。5． 可直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞的细胞因子有_____ 和_____ 。6． 介导炎症反应的细胞因子主要包括 _____、_____ 、_____ 、_____ 和_____ 。三．名词解释1． 细胞因子(cytokine,CK)2． 白细胞介素（interleukin,IL）3． 干扰素(interferon, IFN)4． 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)5． 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)四．问答题1． 细胞因子有哪些共同特性？2． 细胞因子的分类及生物学活性有哪些？3． 试述细胞因子是如何调节B细胞和T细胞的？4． 试举出细胞因子及其相关制剂对其有治疗或预防价值的六类疾病。参考答案一．选择题【A型题】1.B2.B3.D4.A5.E6.A7.A8.E9.D10.D11.E12.C13.A14.B15.E16.B17.C18.B【X型题】1.ABC 2.ABCDE 3.ABC 4. ABCD 5. ABCD二、填空题1． 白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子、趋化性细胞因子2． 白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞、活化T细胞、NK细胞3． 调节固有免疫应答、适应性免疫应答、刺激造血、诱导细胞凋亡、直接杀伤靶细胞、促进损伤组织的修复4． 旁分泌、自分泌、内分泌5． TNF- α、LT-α6． IL-1、IL-6、TNF、趋化性细胞因子三、名词解释1． 是由免疫原、丝裂原或其它因子刺激细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质，具有调节免疫应答、刺激造血、杀伤靶细胞和促进损伤组织的修复等生物学活性。2． 主要由白细胞分泌及介导白细胞及其它细胞间相互作用的细胞因子，主要作用是调节细胞生长分化、参与免疫应答及介导炎症反应。3． 由Mo-MΦ、成纤维细胞、病毒感染细胞及活化的T细胞和NK细胞等产生的细胞因子，具有干扰病毒感染和复制的能力而得名，此外还具有抗肿瘤和免疫调节作用。干扰素可分为α、β和γ三种类型。IFN-α/β也称为I型干扰素，IFN-γ也称为II型干扰素。4． 是一种能使肿瘤发生出血坏死的细胞因子，分为TNF-α和TNF-β（LT）两种，前者主要由活化的单核-巨噬细胞产生，TNF-β主要由活化的T细胞产生。主要有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、促炎作用及致热等作用。5． 指能够刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。主要有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、单核-巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、干细胞因子（SCF）等。四、问答题1．①多为小分子多肽。②高效性：微量（pM）就可对靶细胞产生显著的生物学作用。③须与相应受体结合才能发挥作用。④可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。⑤多效性、重叠性、拮抗效应和协同效应。⑥ 网络性：相互促进或制约。⑦以非特异方式发挥作用，即细胞因子对靶细胞作用无抗原特异性，也不受MHC限制。2． 按照结构与功能，细胞因子可被分为六类：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子。细胞因子的生物学活性：调节固有免疫应答、适应性免疫应答、刺激造血、诱导细胞凋亡、直接杀伤靶细胞、促进损伤组织的修复。3．细胞因子调控B细胞和αβT细胞的活化、增殖、分化和效应。对B细胞的作用：主要为Th2细胞分泌的IL-4，5，6，10，13可促进B细胞的活化、增殖和分化，调控B细胞分泌Ig的类别转换，如IL-4可诱导IgG1和IgE产生，IFN-γ诱导产生IgG2a和IgG3，TGF-β可诱导IgA的产生。对T细胞的作用：IL-2,7,18等可活化T细胞并促其增殖。IL-12和IFN-γ诱导Th0分化为Th1，IL-4诱导Th0分化为Th2，IL-1,6促进分化为Th17，TGF-β促进分化为Treg。IL-2,6和IFN—γ明显促进CTL的分化并增强其杀伤功能。4．感染性疾病；肿瘤；移植物的排斥；血细胞减少症；超敏反应；自身免疫性疾病。}