免疫测定技术的发展趋势
核心提示：众所周知，现代免疫学的发展与微生物学尤其是细菌学是密不可分的，临床免疫测定技术的发展亦是如此。临床免疫检验技术的出现最早可追溯至十九世纪末。1896年，Widal发现在一定浓度的伤寒杆菌中加入伤寒病人的血清可致伤寒杆菌发生特
　　众所周知，现代免疫学的发展与微生物学尤其是细菌学是密不可分的，临床免疫测定技术的发展亦是如此。临床免疫检验技术的出现最早可追溯至十九世纪末。1896年，Widal发现在一定浓度的伤寒杆菌中加入伤寒病人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早的用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验(Widal test)。该试验出现后，一百多年来一直用于临床检验。稍后，1897年Kraus又发现将细菌培养液与其相应的抗血清混合后可发生肉眼可见的沉淀反应，于是，免疫沉淀试验又应运而生。到1900年，维也纳大学病理解剖系的年仅32岁的助教Landsteiner发现一些人的血浆能使另一些人的红细胞凝集，这种同种凝集现象的发现，成为人类血型分类的基础，并由此而衍生了生物科学中的一个特殊分支即免疫血液学，Landsteiner也因人类血型的发现获得了1930年的诺贝尔生理学或医学奖。并且，直至今天，我们仍然在使用基本的红细胞凝集试验鉴定ABO血型。在同一年代，Bordet又发现了补体结合试验(Complement fixation test, CFT)，即抗原抗体反应后具有补体结合的能力，如红细胞与溶血素反应后，如有补体存在即可出现溶血现象。因此，利用这种免疫溶血机制做指示系统，可以检测另一反应系统中抗原或抗体的存在与否。1906年Wassermann将这种试验用于梅毒螺旋体感染的诊断，建立了著名的用于梅毒血清学诊断的华氏反应。免疫沉淀和免疫凝集试验属于经典的免疫测定技术，现在仍常用的免疫沉淀试验有单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫固定电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫透射比浊、免疫散射比浊、免疫胶乳增强比浊等;常用免疫凝集试验有间接血凝试验、胶乳凝集试验和明胶颗粒凝集试验等。
　　标记免疫测定技术标志着免疫测定技术进入到了高灵敏免疫测定的时代。1941年Coons等建立的荧光抗体技术(Fluorescent antibody technique)为定位组织和细胞中的抗原物质提供了一个直接而又有效的手段。在20世纪40年代以前，所出现免疫测定技术基本上都是定性或半定量测定方法，到50年代末60年代初，才出现完全的定量测定方法，即放射免疫试验(Radioimmnuoassay, RIA)。1960年，纽约退伍军人医院(the Veterans Administration Hospital)的Berson 和Yalow发表了内源性血浆胰岛素测定的RIA方法。高灵敏放免测定技术的出现，解决了以前难以测定的微量生物活性物质如激素的临床检测问题，其发明者之一Yalow 因此而获得了1977年的诺贝尔生理学或医学奖，Berson因为1972年就已去世，所以没能与Yalow一起分享这个荣誉。尽管放免测定技术的出现是免疫测定技术发展史上的一个里程碑，但由于其有试剂半衰期短，实验废液难以处理，污染环境等缺点，使得其现已逐步退出在临床常规检验中的应用，而采用非同位素标记物建立标记免疫测定技术成为发展主流。1966年，法国巴斯德研究所的Avrameas和Uriel以及美国的Nakane和Pierce同时报道了酶免疫测定技术。其将酶替代荧光素，用于抗原在组织中的定位，可通过光学显微镜和电子显微镜来观察。并且Avrameas报道了将酶通过戊二醛方法标记抗原和抗体的理想条件。60年代末，在酶免疫组织化学的基础上，瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann、荷兰Organon公司的VanWeeman和Schuurs等以及法国巴斯德研究所的Avrameas等同时发展了一种酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。Engvall和Perlmann以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)作为标记物，建立兔血清IgG的定量ELISA测定方法。VanWeeman和Schuurs则以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)作为标记物，建立定量检测人尿中hCG的ELISA方法。Avrameas等以酶标记抗原建立了血清IgG测定方法。这种简单方便的免疫测定技术出现后，不但成为了一种非常简便的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐步取代了放免技术。其后，1972年Rubenstein等又建立了一种无需分离洗涤步骤的均相(Homogeneous)酶免疫测定技术—酶放大免疫分析技术(Enzyme multiplied immunoassay technique, EMIT)，这种测定技术主要限于小分子物质如药物等的测定应用。随着70年代中期杂交瘤技术的发展，出现了单克隆抗体，其应用于免疫测定，极大地提高了免疫测定的灵敏度和特异性，且为不同免疫测定方法的设计提供了广阔的想象空间，各种免疫测定技术相继出现，如一步法双抗体夹心酶免疫测定，各种均相酶标或同位素标记免疫测定方法等。到了80年代，研究人员又发现胶体金可以作为抗体的标记物，建立简便快速的免疫渗滤层析试验，即所谓的金标试纸条。进入90年代，基于不同测定原理不同标记物(酶、发光物、元素化合物等)的各种自动化免疫分析仪，不断应用于临床检验，给我们实验室的日常工作，不但带来了很大的便利，而且其测定较之人工操作更为稳定和准确。自上世纪90年代以来，基因工程免疫测定试剂和基因工程抗体的发展，又一次拓宽了免疫测定技术的发展途径。
　　综观免疫测定技术一百多年的发展历程，可以看出，这种建立在抗原和抗体特异相互作用基础上的临床检验技术，已成为我们认识了解生命未知物质的一个难以替代的手段，其发展的每一步都来自于相关学科研究认识的深入。如果说抗原和抗体特异相互作用，只是免疫测定技术的基本框架，那么标记物、单克隆抗体、固相支持物等等就像是这个框架上最丰富多彩的外装。
　　常用的临床免疫检验项目主要可分为：(1)病原体抗原和抗体。如乙肝“两对半”(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)、抗-HBc IgM、抗-HAV IgM、丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、人类免疫缺陷病毒抗体(抗-HIV)、梅毒抗体、风疹病毒抗体(IgM、IgG)、弓形虫抗体(IgM、IgG)、巨细胞病毒抗体(IgM、IgG)、单纯疱疹病毒抗体(IgM、IgG)等。(2)肿瘤标志。如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)、CA19-9、CA125、CA15-3、CA50、CA72-4、CA242、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、组织多肽特异抗原(TPS)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)等。(3)特定蛋白。如C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白及亚类、补体C3和C4、抗链球溶血素O(ASO)、类风湿因子(RF)、前白蛋白(Prealbumin)、白蛋白(Albumin)、微白蛋白(Microalbumin)β2微球蛋白(β2Microglobulin)、α1抗胰蛋白酶 (α1AT)、铜蓝蛋白(Caeruloplasmin)、结合珠蛋白(Haptoglobin)、转铁蛋白 (Transferrin)、载脂蛋白A(APO-A1)、载脂蛋白B(APO-B)等。(4)激素。T3、T4、促甲状腺激素(TSH)、皮质醇(Cortisol)、卵泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)、孕酮、泌乳素(PRL)、睾酮、雌二醇、C-肽、胰岛素、肾上腺激素等。(5)自身抗体。如类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗ENA抗体、抗组蛋白抗体、抗核小体抗体、抗线粒体抗体、抗嗜中性粒细胞胞浆抗体(cANCA/pANCA)、抗甲状腺球蛋白抗体等。其他还有治疗药物监测(地高辛、苯妥英、茶碱、丙戊酸、卡马西平等)、肌钙蛋白等。
　　在临床意义上，病原体抗原和抗体的检测主要是用于判断相应病原体的感染状态(急性或慢性感染、病原体携带等)，一些如抗-HBs可用于疫苗免疫效果的判断。肿瘤标志由于没有很好的器官特异性，主要用于恶性肿瘤的治疗疗效、复发监测，一般不能用于健康体检肿瘤筛查和诊断，只有个别的项目如AFP、PSA可用于高危人群的健康体检。特定蛋白为血液中具有多种功能的蛋白，如载体蛋白、免疫球蛋白(抗体)、酶、凝血因子等，其含量变化通常与多种疾病有密切关系。如CRP是急性时相反应的一个极为灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。结合临床病史，有助于随访病程。有研究认为，CRP是引发心脏病的最强烈的危险因素，其危险程度是血液中过量胆固醇的2倍。CRP含量高的人患高血压的危险率比胆固醇高的人大1倍。如果炎症和过高的胆固醇同时出现的话，那么患心脏病和中风的危险率比正常的人要高出9倍。由此可见，CRP含量高和患心脏病呈正相关。此外有研究发现，血中高浓度的CRP是结肠癌发病的危险因素，并认为CRP可能是结肠癌的一个早期标志物。免疫球蛋白及其亚类浓度在不同年龄段有所差异，在某些疾病情况下，如慢性肝病、亚急性或慢性感染、结缔组织疾病、IgG骨髓瘤、无症状性单克隆IgG病、遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性IgG缺乏症，蛋白丢失性肠病、肾病综合症、强直性肌营养不良，免疫抑制剂治疗儿童常见的反复呼吸道感染、经常腹泻、发育迟缓等症状以及经常发生的许多呼吸道疾病如中耳炎、鼻窦炎、肺炎、气管炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张以及哮喘等，这些指标的浓度将出现升高或降低，从而具有疾病诊断价值。补体含量下降并不一定代表免疫功能障碍或免疫缺陷，因为在缺血、凝固性坏死和中毒性坏死时，组织能释放较多的蛋白分解酶，导致补体溶血活度和补体组分的下降;血补体浓度升高，常见于各种炎症性疾病及阻塞性黄疸、急性心肌梗塞、溃疡性结肠炎、糖尿病、急性痛风、亚急性和急性甲状腺炎、急性风湿热、皮肌炎、多发性肌炎;混合性结缔组织病;结节性动脉周围炎等。其他特定蛋白的临床意义可参考相应专业书籍。激素测定中不同的激素指标则用于各种内分泌疾病的辅助诊断。如T3、T4和TSH用于甲状腺功能的辅助诊断;LH、FSH和TSH用于判断下丘脑-垂体-性腺轴功能;泌乳素升高则与垂体泌乳素瘤、垂体生长激素瘤、原发性肾上腺和甲状腺功能减退、肝病等有关，降低则与垂体前叶功能减退有关。其他激素测定的临床意义可参考相应专业书籍。自身抗体检测主要是用于自身免疫病诊断、疾病状态判断和疗效监测。
　　《临床实验室》：现在广大临床工作者对免疫检验项目正常值的设立和质控存在疑惑，您对此有何见解?
　　李教授：正常值又称“参考范围”，这个概念属于定量测定范畴。长期以来，我国临床定量测定(包括定量免疫测定)所使用的“参考范围”基本上源于国外教科书，是非黄种人的数据，从严格意义上说不适合于中国人群，但长期以来的使用并没出现大的问题，原因可能有两个：(1)绝大部分指标的“参考范围”在不同人种间的差异不大，再加上较大的“参考范围”，不会影响到临床医疗实践中临床医生的决策。(2)绝大部分定量检测指标其所具有的疾病诊断价值基本上处于辅助诊断的地位，其本身(单独一个指标)对疾病诊断并不具备决定性意义。在临床医学实践中，不管是实验室工作人员，还是临床医生，可能有很多对“参考范围”看得很重，其实之所以称之“参考范围”，其内在含义就是仅供“参考”，对于特定的患者来说，其某一个免疫检测指标的定量值是否正常，最重要是对其这个指标的长期的检测观察，比如说，某个人某个指标稍高于或稍低于“参考范围”，似乎不正常，但如果该人这个指标长期的检测值变化不大，则说明该个体的“正常值”要稍高于或稍低于人群的“参考范围”，其并无任何的疾病指示意义。所以临床检验的“正常值”，从某种意义上说，也是具有个体化特征的。
　　关于免疫检验的室内质量控制，临床实验室工作人员常感到很困惑，不知从何做起。原因主要有以下几个：(1)ELISA测定的手工操作。现今临床生化检验基本上都使用全自动生化分析仪，仪器均带有质控作图软件，实验室工作人员基本上不用怎么费事即可完成质控任务。而免疫测定最为常用的ELISA多为手工操作，一般没有质控作图软件，需要实验室技术人员自己独立去绘制及确定判断失控的规则，所以难免会觉得有难度。(2)对室内质控的意义理解不够。可能有相当部分的实验室做室内质控，只是当做一件任务去完成，按规则在控即万事大吉，而缺乏对室内质控的定期充分分析，从分析中发现测定中可能存在的质量问题。(3)免疫测定的特点。免疫测定可分为定量和定性两类，对定量测定，采用生化检验常用的统计质控方法如L-J质控图方法，觉得比较容易理解。对定性测定，由于不同批试剂盒间对同一份质控样本的测定的S/CO值差异可能会较大，感到很难使用类似定量测定的L-J质控图方法，对“即刻法”了解不多，不知如何应用。(4)快速免疫测定如胶体金(硒)试纸条检测的质控问题。这种“床边”测定方法不需要采用室内质控品进行即时检测的室内质控，因为试纸条本身已有质控，如通常的“质控或对照线”。
　　实际上，免疫测定，不管是定性还是定量，如采用统计学质控方法，同生化及其他检测是相通的，统计质控方法的基本依据是一件事情发生的概率，如一件发生概率很小(如&0.27%或5%)的事件发生，我们就将其视为有可能是测定错误所致(即视为失控)，此时就需要分析原因，确定是否有错误发生，必要时对全部或部分样本进行重新检测。L-J质控图方法的13S规则，其内在统计学含义就是出现了概率&0.27%的事件，12S规则就是出现了概率&5%的事件，后者，显然假失控的概率太大，所以，我们通常将12S作为告警规则。限于篇幅，这里只是对有关质控问题进行一个简单的解释，具体可以参考相关的专业书籍，如《全国临床检验操作规程》(第三版)和《临床酶免疫测定技术》(李金明编著，人民军医出版社 2005)。
　　《临床实验室》：免疫测定技术的临床应用发展最快、最具前途，请您介绍一下免疫测定技术的最新应用。
　　李教授：在临床检验中，可以说免疫测定技术的应用非常广泛，这主要是因为免疫测定技术中的抗原和抗体的结合特点所致，换句话说，只要是能得到某物质的特异抗体，就可以建立该物质的免疫测定方法，反之亦然。所以，一些以前需要采用复杂的化学方法和物理方法如高效液相层析、色谱和质谱等检测的物质，现在有很多都可以使用简单价廉的免疫学方法检测，如糖化血红蛋白(HbA1c)、小分子药物和激素等。我们说，免疫测定技术很具有发展前景，与单克隆抗体技术、基因工程技术乃至物理学、化学和材料科学的发展是分不开的，也得益于其测定模式相互结合。如四代丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)测定ELISA方法的发展、可测出HBsAg变异体的ELISA试剂盒的出现、结合液相抗原抗体结合磁性微球固相分离的全自动免疫分析方法(较固相ELISA方法的测定时间大大缩短)、利用胶乳凝集增强敏感性的胶乳增强散射免疫比浊法、均相的克隆酶供体免疫测定(cloned enzymedonor immunoassay，CEDIA)、西门子公司的均相免疫测定方法发光氧通道试验(The luminescent oxygen channeling assay，LOCITM)、流式荧光免疫测定技术(Luminex，又称液相芯片)、蛋白芯片技术等。
　　《临床实验室》：以上免疫测定技术与临床相结合时存在哪些难点?如何突破呢?
　　李教授：免疫测定技术多种多样，免疫测定新技术仍层出不穷，以上免疫测定技术绝大部分都较为成熟，可以很好的用于临床实验室实际检测应用，一些免疫测定技术目前仅限于研究，如免疫PCR、纳米颗粒标记免疫技术、量子标记免疫测定技术以及一些免疫传感器等。免疫测定技术的发展，要做到可以在临床实验室常规实际应用，必须达到以下基本要求：(1)简便易行;(2)特异灵敏，结果准确;(3)有可重复性。在研发新的临床免疫测技术或方法前，不能只是追求“概念”新奇，使本来可采用简单方法解决的问题复杂化，以及一些只能用于科研的方法去尝试用于临床常规检测，如目前仍有很多人关注的一些蛋白芯片测定方法、蛋白质组学方法等。这些方法通常较常用常规方法复杂很多，最大的问题是通常没有可重复性，临床无法应用。因此，有关的试剂和/或仪器生产厂家，在将某种新的免疫测定技术用于临床检验前，首先要思考的一个问题是，新技术与现有方法之间相比，有什么样的优点，是更为简便快捷，还是更灵敏特异，以及试剂成本价格是否更低廉。其次要考虑的，就是这种技术或方法的成熟程度，也就是能不能实际应用。
　　《临床实验室》：根据上述免疫测定技术的最新应用，您认为临床免疫检验的发展趋势是什么?
　　李教授：免疫测定技术不存在落后和先进之分，经典的免疫沉淀和免疫凝集试验，我们至今乃至以后相当长的一段时间，都是临床实验室的常规免疫检验方法，有其独特的应用领域，如不需要高灵敏方法的体内含量较变的物质的测定，如特定蛋白、一些感染性疾病的抗体等。标记免疫测定技术的发展主要在于各种新标记物的出现，如纳米粒子标记、量子标记、荧光素及其淬灭剂标记(利用于荧光共振能量转移原理的均相免疫测定方法)等。随着抗体制备技术、基因工程技术、物理学、化学和材料科学的发展，临床免疫测定技术将不断发展，从可以准确预测来看，无疑是自动化，利用各种测定原理的全自动免疫分析仪将不断地用于临床检验，这是与临床检验要求结果准确、重复性好、操作简便、结果报告快速分不开的。
（实习编辑：陈战锋）
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抗独特型抗体在小分子物质免疫检测中的应用
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临床免疫学
一、选择题
【A1型题】
1．用抗人CD3单克隆抗体检测T淋巴细胞，其结果代表
T淋巴细胞总数
CD4＋T细胞数
CD8＋T细胞数
2．下列指标可以评价AIDS病人的细胞免疫功能的是
CD2/ CD3细胞比值
CD3/ CD4细胞比值
CD3/ CD8细胞比值
CD4/ CD8细胞比值
CD2/ CD4细胞比值
3．分离外周血单个核细胞，单次差速密度梯度离心法常用分层液是
Ficoll-Hypaque分层液
Percoll分层液
4. 已知细胞中的粘附能力最大的为
巨噬细胞或单核细胞
5. Ficoll液单次密度梯度离心后外周血细胞分布由上至下依次为
单个核细胞
、血小板和血浆、粒细胞、红细胞
血小板和血浆、粒细胞、单个核细胞、红细胞
血小板和血浆、单个核细胞、粒细胞、红细胞
血小板和血浆、单个核细胞、红细胞、粒细胞
血小板和血浆、红细胞、单个核细胞、粒细胞
6. 用于T细胞亚群分离的方法有
E花环沉降法
尼龙毛柱分离法
免疫磁珠分离法
Ficoll分离法
Percoll分离法
7. 细胞活力测定常用的简便方法是
台盼蓝染色
8. 密度法分离免疫细胞技术中分离各类细胞的关键是
9. 淋巴细胞分离方法中的贴壁粘附法是利用单核细胞的如下特点
贴壁生长特点
体积不同特点
形态不同特点
比重不同特点
抗原不同特点
10. 将T、B细胞进行分离时所采用的尼龙毛柱分离法利用B细胞和单核细胞的如下特点
体积不同特点
具有粘附于尼龙纤维表面的特点
形态不同特点
贴壁生长特点
具有吞噬性的特点
11. 分离纯化淋巴细胞亚群的基本原理是
相应细胞体积不同特点
相应细胞具有不同的表面标志
形态不同特点
相应细胞贴壁生长特点
相应细胞具有吞噬性的特点
12. 采用Ficoll密度梯度分离法分离得到的细胞主要为
单核细胞和粒细胞
淋巴细胞和单核细胞
淋巴细胞和粒细胞
13. 为B细胞所特有、是鉴定B细胞可靠的指标是
小鼠红细胞受体
14. 在进行受者血清中细胞毒性预存抗体测定时，运用台盼蓝染色法，下列叙述正确的是
着色者为死细胞，有细胞毒性预存抗体存在
着色者为活细胞，无细胞毒性预存性抗体存在
着色者为死细胞，无细胞毒性预存抗体存在
不着色者为死细胞，表明有细胞毒性预存抗体存在
不着色者为死细胞，表明无细胞毒性有抗体存在
【A2型题】
15．对淋巴细胞亚群测定的临床意义描述错误的是
了解机体的免疫状态
探讨免疫调节功能的状况
是自身免疫疾病和肿瘤发生发展的监控指标
了解体液免疫情况
诊断免疫缺陷或免疫增生病
16.免疫细胞分离中不是对分离液的基本要求为
对细胞无毒
不溶于血浆等分离物质
有一定的比重
一定是有色的液体
17.下列说法错误的是
进行细胞免疫的检测，一般须将待检淋巴细胞从血液中或组织中分离出来
外周血单个核细胞包括淋巴细胞、粒细胞和红细胞
利用外周血的细胞的理化特性的差异可以分离不同的细胞群体
淋巴细胞的理化特性与其他细胞差异很小，用简单的方法不易分离纯化
淋巴细胞的分离利用专门的淋巴细胞分离纯化技术
18.关于单个核细胞说法错误的是
单个核细胞包括淋巴细胞、单核细胞
单个核细胞的体积、形态、比重与其他细胞不同
可利用单个核细胞的体积不同，按照密度梯度来分离
在进行密度梯度分离时，单个核细胞比重比溶液的比重大
多核粒细胞比重比单个核细胞比重大
19. B细胞的重要表面标志不包括
膜免疫球蛋白（SmIg）
EB病毒受体
小鼠红细胞受体
20.从单个核细胞悬液中分离出单核细胞的方法不包括
E花环沉降法
贴壁黏附法
吸附柱过滤法
D 磁铁吸引法
E percoll分离液法
21.下列关于T细胞亚群的分离，说法错误的是
原理是根据相应细胞的不同标志加以选择性纯化
凡根据细胞的表面标志进行纯化得到所需要的细胞群是阳性选择法
选择去除不需要的细胞群，仅留下所需要的细胞为阴性选择法
尼龙毛柱分离法是常用的分离方法
FACS是最先进的细胞分选技术
22.T、B细胞分离的方法，不包括
Ｅ花环沉降分离法
自然沉降法
尼龙纤维分离法
亲和板结合法
流式细胞仪分离法
23.关于NK细胞及其表面标志的检测，说法错误的是
NK细胞表面少有受体
NK细胞参与免疫应答
过去主要检测NK细胞的活性来了解NK细胞的功能
目前临床采用荧光标记检测NK细胞
NK细胞表面存在CD2、CD16等多种抗原，是NK细胞特有
24.不能从单个核细胞中去除单核细胞的方法有
粘附贴壁法
吸附柱过滤法
磁铁吸引法
亲和板结合分离法
25.不能实现T、B细胞分离的方法有
Ｅ花环沉降分离法
自然沉降法
尼龙纤维分离法
亲和板结合法
流式细胞仪分离法
26.关于淋巴细胞分离的描述错误的是
A. Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法
B. 温度可影响Ficoll分离的细胞收率
C. 为获得较纯的单个核细胞，需根据待分离细胞的比重适当调整分离液的比重
D. 采用贴壁粘附法分离到的淋巴细胞群中不会损失B细胞
E. Percoll分离是一种连续密度梯度离心分离法，是纯化单核细胞和淋巴细胞的一种较好的方法
T、B淋巴细胞分离描述中错误的是
A. E花环沉降法利用T细胞有羊红细胞受体，将T细胞和B细胞分离。
B. 尼龙毛柱分离法利用Ｂ细胞和单核细胞对尼龙纤维表面的易粘附性，可将Ｔ和Ｂ细胞分开。
C. 磁性微球分离法中需要获得的细胞不与磁珠结合，而是游离于上清液中，即为负选法。
D. 利用CD分子可进一步对细胞亚群进行分析
E. B细胞表面的Fc受体是鉴定B细胞可靠的指标。
【B1型题】
（28-30题共用备选答案）
28．区分B细胞亚群的标志是
29．Th淋巴细胞的标志是
30. 单核-巨噬细胞的典型标志是
二、名词解释
1．单个核细胞
3. 细胞分离的正选法和负选法
4. 表面标志亚群
5. 免疫磁珠
三、简答题
1. 简述利用磁性微球分离淋巴细胞的原理。
2. 对淋巴细胞的计数和功能检测意义有何不同？
3. T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞的主要生物学标志是什么？
4. 细胞表面标志的检测方法有哪些？
5. 将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？
一、选择题
二、名词解释
1．单个核细胞：指淋巴细胞和单核细胞。
2．Ficoll液：一种聚蔗糖-泛影葡胺混合液，用于分离外周血淋巴细胞。
3．细胞分离的正选法和负选法：磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞为正选法；磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞为负选法。
4. 表面标志亚群：通过一个或几个CD抗原定义出来的细胞亚群。
5. 免疫磁珠：指以免疫特异抗体或其它免疫物质包被的磁性塑料微球。
三、简答题
1. 简述利用磁性微球分离淋巴细胞的原理。
答：磁性微球是将磁性材料颗粒表面进行处理，核心外包裹高分子材料（聚苯乙烯、聚氯乙烯等），可结合不同的生物大分子物质（抗原、抗体、核酸等），若微球表面包被于免疫配基者称为免疫磁珠（lmmunomagntic bead, IMB），其兼有免疫配基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场时磁性消除。将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成细胞－抗体－磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其它细胞将产生明显的差别。可以采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞则将先被洗脱出来，再将该柱移出磁场，与磁珠结合的细胞也将被洗脱出来，达到分离的目的。
2. 对淋巴细胞的计数和功能检测意义有何不同？
答：淋巴细胞计数主要是T、B细胞及其亚群计数，通过计数可了解T、B细胞的数量与比值是否正常。淋巴细胞数量正常并不等于其功能正常，T、B淋巴细胞对抗原、丝裂原的刺激能否发生增殖反应是判定功能是否正常的一个检测标准。如淋巴细胞受丝裂原等物质刺激后能发生增殖反应即发生母细胞化，则说明其功能正常。CTL与NK 细胞的功能是否正常，以能否杀伤靶细胞来判定。由此可知，计数是对物质基础的定量，功能检测是对物质功能的定量，要把各种免疫细胞及亚群的数量与比值，各种免疫细胞功能的测定结果等进行综合分析后，才能判定机体的免疫功能是否正常。
3. T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞的主要生物学标志是什么？
答：外周血中成熟的T淋巴细胞主要属于TCRαβ+T细胞，T细胞功能复杂，表面标志也不单一，因此Ｔ细胞实质也是由多种细胞所组成的一类细胞，一般认为CD3是Ｔ细胞共有的标志。根据Ｔ细胞的免疫效应功能至少可以分为：辅助性Ｔ细胞（CD3+CD4+CD8-）、细胞毒性Ｔ细胞（CD3+CD4-CD8+）和调节性（CD4 +CD25 +）。
Ｂ细胞表面的膜免疫球蛋白为Ｂ细胞所特有，常用鉴定和研究的B细胞的CD抗原有：CD19、CD20等。近年发现CD5+CD19+B细胞，与免疫调节及自身免疫性疾病和某些恶性血液疾病关系密切。临床实验室经常对CD5+CD19+B细胞进行检测以对有关疾病做出诊断。
NK细胞是一类无典型T细胞和B细胞的表面标志的大颗粒淋巴细胞，目前多以CD3-、SmIg-、CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标志。
单核-吞噬细胞的典型的典型表面标志是CD14。
4. 细胞表面标志的检测方法有哪些？
答：有抗体致敏细胞花环法、免疫细胞组织化学法和流式细胞计数法等。目前免疫细胞表面标志的检测主要采用流式细胞技术，结果客观准确，重复性好。CD抗原的鉴定是以流式细胞仪测量法为主要依据，其它方法仅为参考。
5．将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？
答：早期的免疫细胞分离技术主要是根据不同免疫细胞的物理属性（如比重不同）和生物学属性（如粘附力不同）进行分离的，用目前的标准看其分离的灵敏度或分辨率都不高，因为某种细胞与另一种细胞的比重或粘附力往往不是截然不同的，处于中间状态的细胞也很多，因此这类分离方法的收率和纯度往往不能兼顾，但作为一种传统的分离手段其分离效果已被某些实验认可，如用单个核细胞进行的某些实验，一般被认为可以代表淋巴细胞，如无特别需要一般并不采用分纯淋巴细胞的替代技术。做为富集某一类细胞的手段，传统的方法仍不失为简便和行之有效的技术。
近期发展起来的细胞分离技术大多是基于利用细胞表面标志（抗原或受体）进行分离细胞的，以较早出现的细胞亲和层析为代表。较早出现的有细胞固相包被技术，细胞淘洗技术，同时出现的还有流式细胞仪分离技术，随着合成磁性微球的发展，免疫磁性微球在分离细胞方面已经获得了快速的发展。这些技术的出现使细胞分离技术产生了实质性的进步。
以细胞表面标志物为分离标志的细胞分离技术依赖于对细胞表面标志的研究水平，对细胞表面标志研究未明的细胞进行分离时采用这类技术应当慎重，因此目前尚不能完全替代经典的细胞分离技术。}