关于中和消化液需要的血清量(血清,消化液,胰蛋白酶消化,中和作用) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 关于中和消化液需要的血清量(血清,消化液,胰蛋白酶消化,中和作用)
摘要: [关于中和消化液需要的血清量(血清,消化液,胰蛋白酶消化,中和作用)] 用胰蛋白酶消化细胞后，需要用血清中和。但是，具体这种中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之间的比例是多少，希望有战友能够告知。谢谢！ 关键词:[血清 消化液 胰蛋白酶消化 中和作用 胰蛋白酶]……
用胰消化细胞后，需要用血清中和。但是，具体这种中和作用所要求的胰和之间的比例是多少，希望有朋友能够告知。谢谢！
回复做了很久的试验，真的没有想过胰酶和的对应关系。不过细想下来，这个应该也没有固定的比值。血清的品种都是不同的，成分必然有差异，如何能确定其与胰酶的比值关系？我们消化细胞的时候，如果是传代，细胞变形后，吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培，这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中止消化的。不会存在继续消化的事情。如果是从组织上消化细胞做原代培养，我一般都使用全培进行中止，而且加的很多，0.25％的胰酶，用10％血清，按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2，一般我养细胞的时候，会用国产的比较便宜的血清配制全培，专门用于中止消化，这样有几个好处：一是中止消化的效果应该好于hanks液吧，再是也有利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉，血清便宜，离心掉了不会心疼。而养细胞的时候用好血清。个人观点，仅供参考。回复那天在网上搜了一下，没有这方面的介绍，工具书里面也都没有提及。难道大家都是这样依靠经验么。经验也应该有依据吧，有教科书或文献中提及么？我也是养了比较长时间的细胞，因为开始的时候是师兄师姐带的，没有考虑那么多。现在需要摸索更好的培养条件，所以希望知道一个究竟。希望有朋友能够告知。
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中和试验的检查过程
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(一)简单定性中和试验　　本法主要用于检出病料中的病毒，亦可进行初步鉴定或定型。先根据病毒易感性选定试验动物(或鸡胚、细胞培养)及接种途径。将病料研磨，并稀释成一定浓度(约100 LD50-1 000LD50或TCID50)。污染的病料需加抗生素(青霉素、链霉素各200-1 000单位)，或用细菌滤器过滤，与已知的抗血清(适当稀释或不稀释)等量混合，并用正常血清加稀释病料作对照。混合后置37℃1h，分别接种实验动物，每组至少3只。分别隔离饲喂，观察发病和死亡情况。对照动物死亡，而中和组动物不死，即证实该病料中含有与该抗血清相应的病毒。本法亦可用于毒素(如毒毒素)的鉴定和分型。　　(二)固定血清稀释病毒法　　本法多将病毒作10倍递增稀释，分置2列试管，第一列加正常血清(对照组)，第二列加待检血清(试验组)。混合后，置37℃作用1h，将各管混合液分别接种选定的试验动物，每一稀释度用3-5只动物。接种后，逐日观察，并记录其死亡数，观察结束后，计算LD50和中和指数(表7-1、表7-2)，本法适用于大量检样的检测。　　本法多用以检出待检血清中的中和抗体，对病毒而言，通常中和指数大于50者判为阳性，10-49为可疑，小于10为阴性。　　(三)固定病毒稀释血清法　　本法用以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液(与血清混合后，每一接种剂量含病毒100LD50)，摇匀后，置37℃作用1h，接种实验动物。　　注：[1] 接种剂量0.1ml，含病毒100LD50;供丹垛柑艹纺讹尸番建　　[2] 系指与病毒混合后的稀释度;　　[3] 分母为接种数，分子为保护数;　　[4] PD50为半数保护，其计算法同LD50的计算。　　(四)空斑减少法　　在细胞培养上进行病毒中和试验，近年来多采用空斑减少法。先将病毒稀释成适当浓度，使每0.2ml含80个-100个PFU(空斑形成单位)，与不同稀释度的待检血清等量混合，置37℃作用1h-2h，分别测定PFU，使空斑减少50%血清稀释度即为该血清的中和价。见表7-4。　　表7-4 空斑减少法中和试验示例　　注：[1] 血清用4倍递增稀释;　　[2] 空斑减少50%的血清稀释度，其计算法同LD50的计算。
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一、试验目的
血清分型。
二、实验材料准备
出血热恢复期病人血清
（1） 毒株 汉滩病毒标准株 76-118，汉城病毒标准株 Seoul；
（2）标准血清 兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清；
（3）空斑减少中和试验常用试剂。
将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1：10，56℃灭活30分钟；
进一步2倍稀释血清成1：20、1：40、1：80……，对照血清1：10稀释；
稀释两种病毒（在冰浴中进行）至含200 pfu/ml；
各连续稀释度血清分别与200 pfu/ml的两种病毒液等量混合（各0.3 ml），置37℃中作用1小时（每15分钟振荡一次）；
吸出各细胞培养孔中维持液；
接种长满单层的Vero-E6细胞（24孔板），每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ，每稀释度两孔，100 ul/孔。37℃吸附1小时，每隔15分钟摇动一次；
加第一层琼脂糖覆盖液（需冷置42℃左右），每孔1 ml，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培养7-9天；
加第二层含中性红琼脂糖覆盖液，1 ml/孔，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培养2-5天，从第二天开始观察空斑数；
抗体滴度的判定，以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度；
型别判定：根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分，如果一份血清与汉滩病毒 （或汉城病毒）反应的抗体滴度高于与汉城病毒（汉滩病毒）的抗体滴度4倍或以上，即判为汉滩病毒型，反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时，则不好分型。不足4倍时亦不能定型。
第一层琼脂糖覆盖液
第二层琼脂糖覆盖液 基本上同第一层琼脂糖覆盖液，仅将灭活胎牛血清改为5 ml，另加中性红溶液1 ml（333.0 ug/L中性红钠盐Gibco）。
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