基因检测项目市场前景分析
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摘要: 基因检测项目市场前景分析日，人类基因组计划草图绘制完毕，26日：中、美、日、德、英、法六国联合宣布“人类已经进入基因时代。”日解读人体基因密码的“生命之书”宣告完成。 什么是基因？ ...
基因检测项目市场前景分析日，人类基因组计划草图绘制完毕，26日：中、美、日、德、英、法六国联合宣布“人类已经进入基因时代。”日解读人体基因密码的“生命之书”宣告完成。&&& 什么是基因？基因是决定生命现象生、老、病、死的基本因子，是生命的操纵者，主宰着生命的一切。可以这么说，世界上发生的一切都与基因息息相关。&&& 随着基因领域的研究和发展，基因生物行业已经成为二十一世纪的主角。1、惊人而庞大的市场需求&&&
美国去年有500多万人接受基因检测，达30亿美金的市场收益。在英国，基因检测已经在健康超市里出现，美英等发达国家基因检测就像体检一样普及。随着我
国经济的快速发展，人们生活水平的不断提高，消费能力和健康保健意识愈加强烈，估计我国基因检测的人群在5%左右，每年基因检测量至少在300万人次以
上，并且逐年递增，市场空间极其巨大，发展前景十分可观。2、对于疾病预测和指导正确用药具有重要作用&&&
联合国卫生组织公布全世界有60%的病人死于无知。人们都知道疾病在于预防，但预防重在预知，如果不知道自己的基因型而去预防疾病，结果可能适得其反。通
过基因检测，人们可以了解自己的“内因”风险，做到有目的、有针对性的预防。
我国卫生部门统计：每年高达5000万的住院病人，医疗费用开支占到GDP的14%。由于个体对药物的代谢强弱不同，盲目服用药品和保健品不仅造成金钱上
的浪费，还可能会对人体造成伤害。我国每年有250万人因药物不良反应而住院，每年有20万人因不合理用药而死亡。通过基因检测，辩证用药、因人而异，给
病人找到最合适的药物，不仅降低了不必要的医疗支出，提高疗效，更避免对人体造成不必要的伤害。3、基因产业将成为未来的主流产业&&&
基因技术的发展必将给人类的生活和生命带来革命性的变革，它将引发医药业的大革命并带来巨大的市场商机。我国已进入老龄化社会，基因研究将为新医药、新疗
法、新保健、新预防提供持续性发展的保证。以基因工程制药、基因诊断和基因治疗、物种改良和环境改造等为主要内容的基因产业，是人类永远的“朝阳产业”。
全球从IT产业到BT产业（生物技术）是人类历史发展的必然，也是经济发展的必经趋势。据权威统计，预计到2010年，全球基因产值将突破4万亿美元，成
为全球的主流产业。4．基因是国家的战略资源&&&
21世纪是生命科学的世纪。生物产业对生物资源的依赖性，使生物资源成为继国土(矿产等)之后可供争夺的战略资源，而且这种资源是一次性的。我国是世界上
人口最多的国家，也是生物资源最丰富的国家之一，是世界的“基因黄金国”。作为战略性资源，基因资源将是21世纪中国经济发展的最重要资源。我国政府对基
因研究非常重视，从科技部、卫生部到中国科学院，从国家重点项目（863计划）到国家重点基础研究发展计划（973计划），集中我国在该领域最有实力的单
位参与，并成立相关部门保护和支持产业发展。*同志早在1997年就提示：人无远虑，必有近忧。我们得珍惜我们的基因资源。5．世界同步的技术&&& 我国科学家1999年参与人类基因组计划1%，建立了与世界水平同步的基因组研究实力。2002年我国又参与10%人单倍体型图绘制，在基因研究领域取得了许多成就，有些研究成果还居世界领先地位。&&&
二十一世纪是人类了解自我，认识自我的时代，基因生物行业是刚刚开始的朝阳行业，可使整个人类社会发生根本性的革命。
发展前景：比尔o盖茨断言：下一个超过他的富翁一定出自基因领域。全世界以往的任何一个行业都无法与基因生物领域所代表的社会和经济意义相比。对发展而
言，基因产业是前所未有的历史机遇。市场态势：1、这是与每个人都息息相关的产业，目前市场刚刚开始，由于这个产业的前端性，市场竞争很小，但市场需求却非常庞大，在未来几年内，这个产业将以几何级数增长。2、广大民众对基因与健康的重要关系已有更深刻的了解和认识，各种主流媒体：《中央电视台》、《参考消息》、《环球时报》、《人民日报》、《人民政协报》、《文汇报》等，都纷纷抢先报道关于基因的各种新闻和信息。3、越来越多的人通过基因检测已成为健康的受益者，他们同时也是基因产业的传播者。在基因科学家和广大民众的努力和认可下，基因产业正在迅猛发展。4、随着2005年7月国家科技部《中国人口健康基因检测科学社会工程》的立项，这项旨在实现全民健康的伟大基因工程正以势不可挡的市场态势开创基因新时代。市场需求：1、
国外状况：目前，美国、英国等发达国家都是基因检测大国，基因检测已经成为这些发达国家新兴的主导产业。在美国，2002年，当这项业务刚刚出台的时候，
前来要求检测的客户多为富翁。现在，各种慢性病者、运动员和普通人也纷纷来做检测，这说明大家都希望能早点找到让自己更健康的好方法。有人用现身说法证
明，检查暴露了某些自己无法了解的隐患。在英国，保险业务员在销售人寿保险时，必须是要看被保险人的基因图谱的。以便合理的为客户制定保险计划。2、国内状况：在基因科技开发与应用上，中国与发达国家处于同一起跑线。未来我国两到三年内认识到基因检测重要性的人群将达到总人口的15%-20%，约有3亿人的市场潜在需求，每年基因检测量至少在300万人次以上，市场空间非常巨大。
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在时下新兴技术中，哪些有可能解决重大问题并开启新的机会？以下是我
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基因治疗的原理与研究概况
一．目的要求
掌握：基因治疗的原理；逆病毒生活周期及逆转录病毒前病毒的结构特点。
熟悉：基因转移系统的类型；基因内部的调节机制；肿瘤基因治疗的基本策略与常用方法；“自杀基因”分子化疗的基本原理。
了解：基因治疗的发展史；基因转移途径；基因转移的其他病毒载体的结构特点及应用；非病毒载体介导的基因转移系统的特点；治疗基因的受控表达的要求与特点；基因外部的调节机制与治疗基因的诱导表达；单基因遗传病的基因治疗特点与研究进展；反义核酸技术的概念与特点；肿瘤的免疫基因治疗的方法与特点；病毒感染性疾病的基因治疗方法与特点；目前基因治疗存在的问题及解决方法。
二．讲授重点：逆病毒完全的生活周期及逆转录病毒前病毒的结构特点；肿瘤基因治疗的基本策略与常用方法。
三．讲授难点：治疗基因的受控表达与特点。
四、教学方法：多媒体教学
具：多媒体课件
六、讲授内容：
何谓Human Gene Therapy？
基因治疗是现代分子生物学技术与医学科学交叉渗透而形成的一个全新治疗领域。DNA重组、基因转移、基因克隆和表达等技术的迅猛发展，为基因治疗的飞速发展奠定了基础。
基因治疗分类
体细胞(somatic
cell)基因治疗
只限于某一体细胞的基因的改变
只限于某个体的当代
生殖细胞(germline)基因治疗
对缺陷的生殖细胞进行矫正
当代及子代
第一节 基因治疗的策略
1．基因治疗的概念
定义：将目的基因导入靶细胞内，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。
不同的基因治疗策略是以不同的形式利用基因产生治疗效应，因而适用于不同疾病的治疗。
2．基因置换（gene replacement）
定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。又称基因矫正（gene correction）。
目的：纠正缺陷基因，将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。
基因置换的必要条件：
对导入的基因及其产物有详尽的了解；
外来基因能有效地导入靶细胞；
导入基因能在靶细胞中长期稳定存在；
导入基因能有适度水平的表达；
基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。
基因同源重组技术（homologous recombination)
又称为基因打靶(gene targeting），其实现定点整合的条件:转导基因的载体具有与染色体上的DNA相同的序列。这样，带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点进行部分基因序列的交换。
要实现基因置换，需要采用同源重组使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。
定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。
考虑到正常体细胞的生命周期，以及克隆筛选等实验给细胞生长带来的一系列问题尚未解决．因此用同源重组修复异常基因的方法进行遗传病的基因治疗只能作为远期目标。
3．基因添加
基因添加或称基因增补（gene augmentation）: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。
类型:针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，使导入的正常基因整合到基因组中，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。
基因添加与基因置换一样，也必须具备上面提到的5个必要条件。
4．基因干预
基因干预（gene interference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。
此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒的基因。
较常用的方法是采用反义核酸、核酶或者干扰RNA技术等抑制基因的表达。
5．自杀基因治疗
恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。
原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。
图示：自杀基因的作用机制（约2分钟）
（一）自杀基因系统
TK/GCV：单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，或作为DNA链延伸的终止子阻止DNA合成，导致细胞死亡。
CD/5-FC：大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。
（二）旁观者效应
概念:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。
远距离旁观者效应：近年来又有人观察到该效应也影响到远处的肿瘤细胞，使其消除或停止生长，即远距离旁观者效应。
肿瘤细胞的消除有赖于旁观者效应，即转导自杀基因可以影响没有被转导的肿瘤细胞。旁观者效应明显地增强了自杀基因对肿瘤的杀伤作用，在相当程度上弥补了基因转导效率低的问题。
旁观者效应的机制
细胞缝隙连接；细胞凋亡与吞噬；免疫炎症反应；抗肿瘤血管生成等。
6．基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。
（1）基因修饰肿瘤细胞“疫苗”疗法。
（2）基因修饰TIL的过继免疫疗法。
（3）免疫增强基因疗法。
（4）原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法。
第二节 基因转移技术
图示基因治疗的两种途径。
ex vivo(经活体)，即将靶细胞在体外导入外源基因及体外增殖、筛选、药物处理或其他操作后，再输回患者体内。
in vivo (活体内)，即将无复制能力的、含外源基因的重组病毒直接应用于患者体内，此外还包括将脂质体包埋或裸露DNA直接注射到试验者体内等方法。
1．病毒介导的基因转移系统（生物学方法）
病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，而其中用得最多的是逆转录病毒载体 (retrovirus
vector, RV)。
（一）逆转录病毒载体
逆转录病毒是一种RNA病毒，其感染颗粒是由包装蛋白包装的两条RNA链组成，两条RNA链5ˊ端经氢键连接。
包膜上的突起由外膜糖蛋白和穿膜蛋白组成。病毒包膜上有型、亚属特异性抗原决定簇，由外膜蛋白基因(env)编码；在病毒核心内有属特异性抗原，由属核心蛋白基因(gag)编码。
当逆转录病毒进入宿主细胞后，即由逆转录酶转录成环状双链DNA分子，并随机整合至宿主细胞基因组，称为前病毒(provirus)，然后再转录成RNA，并合成包装蛋白，将转录的RNA基因组包装后分泌至细胞外，完成一个完全的生活周期。
图示逆转录病毒的结构及生活周期
逆转录病毒前病毒的结构特点：
（1）两端各有一长末端重复序列LTR；
（2）LTR由U3、R和U5三部分组成：在U3内有增强子和启动子； U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)
；在R内还有poly(A)加尾信号。
（3）病毒有三个结构基因：gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；pol基因，编码逆转录酶；env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)；
（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列ψ及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)；
（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。
图示逆转录病毒感染及复制过程。
逆转录病毒载体为缺陷型逆转录病毒基因组，它由两部分组成：
(1) 逆转录病毒载体：保留病毒颗粒的包装信号ψ，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源的治疗基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。
另一部分为包装细胞，它由另一种缺陷型逆转录病毒（即带有全套病毒颗粒包装蛋白基因，却缺失包装信号ψ的逆转录病毒）感染构建而成，该细胞株能合成包装蛋白，用于逆转录病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒颗粒。
将上述两部分结合使用，即可产生携带治疗基因，而只有一次感染能力的重组逆转录病毒颗粒。
图示逆转录病毒载体系统的组成。
逆转录病毒载体的特点：
①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体所识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。
②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。
③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。
④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。
逆转录病毒载体的主要缺点：随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。
（二）腺病毒(adenovirus，AV)载体
腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导内吞作用进入细胞内，后被腺病毒基因组转移至胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。
腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联，其宿主细胞范围广泛，可感染分裂和非分裂终末分化细胞如神经元等。
图示腺病毒结构特点及感染过程。
腺病毒的优点：基因导入效率高，对人类安全；宿主范围广；基因转导与细胞分裂无关；重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因
腺病毒载体缺点：1）不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。
2）宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂的关键性因素之一。
3）有两个环节可能产生复制型腺病毒：腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。
4）靶向性差。
（三）腺病毒相关病毒载体
腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒，是目前所发现的动物病毒中最小的病毒，其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒存在的条件下才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。
图示AAV的结构。
AAV生命周期的特点：
● 单独不能进行复制；以潜伏感染为主；
● 病毒基因组与细胞共存；
● 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；
● 若细胞受刺激，表达应激基因， AAV基因表达从而使AAV病毒复制；
● 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。
AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。其中一种B19病毒可以高效定位整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。
AAV载体的缺陷：
AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；
感染效率比逆转录病毒载体低。
在40%-80%的成人中存在过感染，
可能会引起免疫排斥。
（四）单纯性疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)载体
HSV具有许多天然特征，适合作为神经组织的基因转移载体：在不同的神经细胞中可建立长期潜伏状态；在病毒进入细胞和建立潜伏状态时，不需要宿主细胞的分裂；在神经元细胞核中，病毒基因可持续存在，不整合至宿主细胞的染色体中，避免了因整合而使宿主细胞基因失活或激活原癌基因的潜在危险。
HSV载体的优点：1）HSV中有许多基因，切除后可明显阻碍其在体内的复制，使之丧失神经毒性；2）切除大部分病毒基因的重组HSV，可克隆较大的外源基因片段甚至多个基因进行转移，而不影响病毒外壳的包装能力；3）HSV在体外可达到很高的滴度，以作为病毒贮备。
2.非病毒介导的基因转移系统（非生物学方法）。
（一）脂质体介导的基因转移技术
1.脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。
基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。
图示脂质体介导的基因转移过程。
（二）受体介导转移技术
将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，即可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子，如多聚赖氨酸来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA团团包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞有效吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。
图示受体介导的基因转移过程。
第一个进行这方面应用研究的受体是仅在肝细胞内产生的去唾液酸糖蛋白受体。它的主要天然配体为去唾液酸血清类粘蛋白。将牛血清白蛋白半乳糖基化也可形成该受体的人工配体，带有这种配体的DNA复合物即可被定向送入肝细胞，而不进入其他组织。
目前研究的配体有胰岛素、表皮生长因子、凝集素、运铁球蛋白和红细胞生成素等等。
这种类型转移技术还存在一些缺点，如DNA复合体进入细胞依赖于配体－受体介导的吞饮作用，而这是一个将配体－受体复合物导向溶酶体的过程。在溶酶体中大部分复合物将被降解和再循环利用，只有少数导入的DNA能够逃避这条途径而进入细胞核发挥作用。
（三）基因直接注射技术
不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射异体DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。
基因直接注射法的优点：
1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；
2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；
3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；
4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。
（四） 纳米转运体
（五）其它方法
非病毒载体介导的基因转移系统中还包括磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE－葡聚糖法、细胞显微注射以及基因枪颗粒轰击等多种物理、化学方法。这些转移方法的效率差异较大，有的需要特殊的仪器，只适合体外基因转移，在基因治疗中极少使用。
列表比较各种基因转移方法的特性。
一、反义RNA
(－) 反义RNA与基因表达调控
利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控通常采用的方法有两种：1.体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。2.构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。
反义RNA用于体内基因治疗，必须解决以下两个关键问题。
l.专一性转移问题： 即如何专一性地对病变细胞进行调控，而不影响其它正常细胞。
2.反义RNA进入靶细胞前的降解问题：
反义RNA抗RNase的能力并不强。将反义RNA注射到体内。体内的RNase就会使反义RNA的有效量迅速减少，剩下的未被降解的反义RNA也无法集中到病灶处而是分散到全身。
（二）受体介导反义RNA技转移术
借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。
受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,因而可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用，提高转移效率。
利用脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）受体介导反义RNA转移时,应先脱去血清类粘蛋白上的唾液酸，得到ASGP，通过化学物质作为中间连接物，将AGSP与多聚赖氨酸（PL）共价结合，得到ASGP-PL复合物，即成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA通过这一途径进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。
利用肝素作为配体在细胞水平可以抑制c-myc基因的表达。利用ASGP受体介导系统，在细胞水平可以专一地抑制乙肝病毒基因的表达。
（三） 反义RNA的应用前景
受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而且在一定程度上补充了转基因治疗的不足：安全性高，反义RNA只作用于特异的mRNA分子，并不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣”。反义RNA设计和制备方便；具有剂量调节效应；能直接作用于一些RNA病毒，在治疗RNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNA基因治疗比一般的DNA基因治疗有更大的优势。利用反义RNA可以直接作用于病毒RNA，阻断RNA病毒的繁殖。
反义RNA技术的发展已经不再局限于反义RNA自身的特性，而是可以让反义RNA带上其它活性，从而使受体介导的反义RNA技术在基因治疗方面更具优势。
例如：用硫代磷酸核苷代替通常的核苷酸，可以增强反义核酸的抗降解作用。
又如，设计出具有核酶活性的反义RNA，不仅可以阻断特定mRNA的翻译，而且能通过它带上的核酶来切割mRNA分子，促进mRNA的降解。已有人利用携带核酶的反义RNA增强了反义RNA对HIV-1的抑制作用。核酶反义RNA技术，必将更加有效地阻断RNA病毒的复制，从而实现RNA病毒的治疗。
二、干扰RNA
（一）RNA干扰现象
对RNA干扰的认识来源于用线虫（C. elegans）和果蝇所进行的实验。最初的实验结果显示，有义链RNA（sense RNA）或反义链RNA（antisense RNA）均能抑制秀丽线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。将特异的双链RNA注入线虫体内可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链RNA和反义链RNA都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。
RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制了该基因的表达。
RNA干扰技术在基因功能研究和人类疾病治疗方面有广阔的应用前景。
（二）RNA干扰的机制
RNA干扰过程主要有2个步骤：（1）小干扰性RNA：长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small
interfering RNA，siRNA）。
（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,
RISC)。该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。阐明siRNA在双链RNA诱发的基因沉默中的作用是RNA干扰研究中最重要的发现之一。
图示RNAi抑制基因表达的过程
除使用人工合成的siRNA之外，人们已经成功地使用质粒载体或病毒载体在细胞内生成siRNA，来特异性地抑制外源性或内源性基因在哺乳类动物表达。
用质粒载体或病毒载体可在细胞内长时间、稳定地生成siRNA。
这些研究将有助于把RNA干扰技术用于治疗人类疾病。在大多数用哺乳类细胞做的RNA干扰实验中，双链RNA比单链RNA更有效。有少数实验结果显示，双链RNA通过其反义链而起作用，但仅使用反义链RNA常常不能在哺乳类细胞中有效抑制基因的表达。
siRNA的发现不仅加深了人们对RNA干扰机制的认识，同时突破了一个用长双链RNA在哺乳类细胞中抑制基因表达时常常遇到的障碍，即非特异性作用。长于30个碱基对的双链RNA常常会激活蛋白激酶而诱发对蛋白质合成的非特异抑
制。siRNA一般不会在哺乳类细胞中诱发这种非特异性抑制。用人工合成的siRNA可特异性地抑制哺乳类细胞中外源性或内源性基因的表达。实验表明，长度为21个碱基、3ˊ末端有2个碱基突出的siRNA活性较高。siRNA诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。
双链 siRNA 能够特异性地抑制序列与之相同基因的表达，这种现象被称为 RNA干扰（RNAi)。
长度为21~23个碱基的双链 siRNA 通过诱导蛋白质复合体 RISC后，与之相结合分解靶基因，抑制靶基因的表达。
siRNA可以进行化学合成以及体外转录合成等，也可以通过质粒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等在细胞内合成。
RNAi可以广泛应用到各种基因功能研究以及发育生物学的研究中，也有望应用到各种疾病的基因治疗中。
（三）RNA干扰的应用前景
RNA干扰现象在生物界普遍存在，以及RNA干扰的作用机制和生物学功能的初步阐明，为RNA干扰技术的应用提供了理论基础。RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。
1. 研究基因功能的新工具
由于RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以特异地使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。
研究表明RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。
RNA干扰技术成功用于构建转基因动物模型，标志着RNA干扰技术将成为研究基因功能不可或缺的工具。
2. 肿瘤的基因治疗
传统反义RNA技术诱发的单一癌基因的阻断，不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNA干扰技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的双链RNA分子，只使用一种双链RNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时使用多种双链RNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。RNA干扰技术可用于治疗有异常基因表达的恶性肿瘤。
K-RAS蛋白为肿瘤发生所必需，bcr/ab1融合基因与人白血病有关，用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。
通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达，能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。
应用RNA干扰技术成功地阻断了MCF-7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。
3. 病毒性疾病的基因治疗&
RNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。用siRNA抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表达，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻碍HIV在细胞内复制。用RNA干扰技术抑制HIV的受体（CD4）或辅助受体（CXCR4或CCR5）在细胞内表达，可阻碍HIV感染细胞。也可通过RNA干扰抑制其他病毒在细胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。
siRNA在病毒感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNA干扰技术能用于许多病毒性疾病的基因治疗，RNA干扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意义。
三、核酶(ribozyme)
天然核酶多为单一的RNA分子，具有自剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。
只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。
在这种情况下，组成核酶的两个RNA分子中，带有被剪切位点的RNA分子实际上是被剪切的靶分子，而与之结合的RNA分子虽然只是构成了核酶的一部分，但实际上是作为一个酶在起作用，这种RNA分子也被称为核酶，基因治疗中应用的就是这种核酶。在基因治疗时，利用这种核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。
(－) 核酶的设计
应用核酶进行基因治疗是通过靶RNA 分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，需要从靶分子和核酶分子两个方面来考虑核酶的设计。
1.选择合适的靶部位,即具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。
2. 核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。
在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。
图示核酶抑制翻译的过程。
核酶两端的引导序列与靶RNA分子的序列互补，起着识别和结合底物的作用。这两段序列可以根据底物核苷酸序列而变动，关键是能够特异性识别并结合靶分子，形成锤头结构的三个螺旋区。引导序列的长度、引导序列识别区域的确定（如抗病毒时选择调节或功能必需区域），在实际应用时还需具体考虑。
（二）核酶的应用
在基因治疗研究领域中，反义核酸技术是一个非常重要的技术。在该项技术的应用中，存在着一个难题，由于 mRNA的拷贝数太多，难以达到完全的抑制。核酶的出现，为这一问题的解决提供了契机。与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击，而更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。
核酶导入细胞的方法：
l. 外源导入：多采用脂质体法，将体外转录合成的核酶通过脂质体包裹后，导入细胞，此种方法将核酶导入细胞的效率较高，每个细胞中可导入 30万个核酶分子。
2．内源导入：指通过真核表达载体在细胞内表达核酶。根据靶序列设计合成核酶的正链和负链的DNA片段；形成DNA双链后，将其克隆至合适的真核表达载体；最后将此载体用适当的方法转入靶细胞或组织，让其表达出核酶，阻断基因表达。
四、 三 链 DNA
脱氧寡核苷酸(ODN)能与双链DNA专一性序列结合，形成三链DNA，来阻止基因转录或DNA复制，此种ODN又被称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（triple helix-forming
oligonucleotides，TFO）。
为了与作用在mRNA翻译水平的反义RNA的反义技术相区别，又将三链DNA技术称之为反基因技术。
（－） 三链DNA与基因表达
ODN以DNA双螺旋分子的专一性序列为靶标，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止基因转录。由于反义RNA技术和核酶技术对于源源不断的mRNA难以一一阻断或剪断，也就难以达到完全抑制。因此，当基因治疗的目的是尽可能完全地抑制特定基因的表达时，必须将注意力转向mRNA的源头，即从转录水平进行抑制。反基因技术给肿瘤及病毒性疾病的治疗提示了一个新的方向。
（二）作用机制
DNA双螺旋内具有同聚嘌吟和同聚嘧啶的H回文区域可发生自身折叠，形成局部的分子内三链DNA结构，同时游离出一段DNA单链。同理，合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶ODN在一定条件下也可以与双螺旋DNA分子中的同聚聚嘌呤和同聚嘧啶区段结合形成局部的分子间三链DNA，这一结构也是由氢键所稳定。三碱基体有C＋GC、GGC及TAT、AAT。能形成三螺旋的ODN必须满足C、G对GC或T、A对AT的识别。靶基因的优势结合位点在15～40 碱基对的范围内，ODN通常结合到双螺旋中同聚嘌吟（A和G）链上；形成三螺旋的ODN不干扰原有双螺旋间的氢键，ODN中每个碱基与双螺旋靶区中的嘌呤碱基形成两个新的氢键。
（三）三链DNA的应用研究
不少基因中存在同聚嘌呤和同聚嘧啶的区域，能够通过TFO对基因表达进行负向调节。能与her-2原癌基因的启动子区域形成三螺旋的TFO可通过竞争性结合抑制转录因子与相应位点的结合，为过度表达HER-2的乳腺癌的治疗带来了可能。
能与人c-myc基因转录起站位点－115 bp处结合形成三链DNA的TFO可在体外转录系统抑制c-myc的转录。
孕激素对于某些肿瘤尤其是生殖系统肿瘤的生长有促进作用，这是通过孕激素受体对孕激素反应基因(PRG)的激活而实现的。实验证明，TFO与PRG的孕激素反应元件的结合，可阻止孕激素受体与PRG的特异性结合，并抑制这一基因的转录。
人类mdr1基因编码一种跨膜糖蛋白，其过度表达与人类肿瘤细胞的多抗药性形成有关。能与这种基因编码区的高嘌呤序列形成三链DNA结构的TFO可对基因表达进行负性调节。这种抑制作用，对于肿瘤化疗来说无疑是一个很好的辅助手段。
第四节&&基因治疗的靶细胞
选择转移基因的靶细胞时考虑的因素：
1.不管是in vivo还是ex vivo基因转移，选择目的基因表达的组织细胞，最好是组织特异性细胞。
2.细胞较易获得，且生命周期较长。
3.离体细胞较易受外源遗传物质转化。
4.离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内仍较易成活。
在基因治疗过程中，要有针对性地选择靶细胞，确保导入的基因能够有效表达并发挥治疗作用。
一、 造血细胞
造血组织细胞在体内多处分布，有较多的遗传病与造血组织相关，骨髓移植方法已经建立，使造血细胞成为基因治疗中最重要的受体细胞。
将基因转移至骨髓多能造血干细胞，则可以使转移基因始终存在于所有造血细胞内。造血干细胞能分化成各系血细胞，具有移植方便、繁殖能力强等特点，因此是基因治疗合适的靶细胞。对骨髓细胞的基因转移实验主要是将基因转移到未分离的骨髓细胞，如果转移后4个月在骨髓和（或）淋巴组织内仍有转移基因的存在或表达，即认为已成功地转染了造血干细胞。近年来造血干细胞分离技术不断完善，对基因治疗的发展无疑具有重要意义。
二、肝细胞
肝脏是重要的代谢器官，许多遗传病都是由于肝特异的基因产物缺陷而引起的，肝脏也是肿瘤的高发部位；此外，肝细胞作为移植细胞也可在异位发挥功能，以肝细胞作为受体细胞是基因治疗研究的热点之一。
肝细胞基因转移的另一个特点就是可以利用受体介导的基因转移系统，在体内直接进行基因转移。有人应用去唾液酸血清类粘蛋白和多聚赖氨酸复合物转移β-半乳糖苷酶基因至鼠肝细胞，转染的肝细胞达0.1 ％。
三、血管内皮细胞
将基因导入血管内皮细胞，可以直接向血液中分泌基因表达产物。已有实验在猪的髂动脉内利用双气囊导管直接向动脉内注入含有β-半乳糖苷酶基因的脂质体，该部位的血管内皮细胞表达β-半乳糖苷酶达5个月之久。
四、淋巴细胞
外周血淋巴细胞中的T淋巴细胞担负着重要的免疫功能，也很容易从体内取出和回输，可以在体外进行培养和扩增，并对目前常用的几种基因转移方法都具有一定的敏感度。应用各种基因转移技术，已将细胞因子、功能蛋白质和选择抗性等基因导入了外周血淋巴细胞并获得稳定高效表达，这是免疫缺陷性疾病、肿瘤、血液系统单基因遗传性疾病基因治疗的一条重要途径。
五、肌肉细胞
骨骼肌细胞的突出特点：骨骼肌细胞中的成肌细胞（myoblast）作为基因治疗的靶细胞具有很大的优势。成肌细胞寿命较长，适于较长期的外源基因表达，来源丰富，容易取出和培养，具有一定的分裂能力，因而对逆转录病毒的感染很敏感，容易移植。成肌细胞中分泌的外源基因表达产物，不仅对骨骼肌组织产生一些生物效应，而且可以进入血液以影响全身。
可采用直接体内基因转移，即将真核表达载体直接注射入骨骼肌。用含β-半乳糖苷酶基因的真核表达质粒直接注射入小鼠骨骼肌，在注射区域的肌细胞可以检测到该基因的表达。
血管平滑肌细胞可进行体外培养，经遗传操作后再送回血管。在体内外实验中，已有将自杀基因和抑癌基因导入血管平滑肌细胞中成功抑制血管壁增厚的报道。
六、肿瘤细胞
各种肿瘤细胞也是基因治疗研究中极为重要的靶细胞类型。视网膜母细胞瘤与wilm瘤都是由于某些基因的缺失而引起的。如果将RB 显性基因转染视网膜母细胞瘤的细胞，获得RB表达以后，可使视网膜母细胞瘤细胞形态正常转化，故RB和Wilm肿瘤的基因治疗必须以肿瘤细胞作为其基因治疗的靶细胞。肿瘤细胞对目前绝大多数的基因转移方法都比较敏感。特别是肿瘤细胞始终处于旺盛的分裂状态，因此，可以进行高效率的基因转导。
七、其它细胞
许多实质性器官细胞也是基因治疗较为常用的细胞类型，除了肝细胞外，还有心肌细胞和脾细胞。但实质性器官细胞的取出一般要借助外科手术。至少也是活检，移植也较为困难，实质性器官细胞对逆转录病毒的感染也不是十分敏感，这些都给基因治疗带来一些困难。
治疗基因的受控表达
治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。
时间有两个方面的内容：1.控制治疗的基因在患者需要实施治疗时才表达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；2.根据不同疾病的治疗要求，控制治疗基因持续表达的时间跨度。
空间是指为了提高基因治疗的专一性和安全性，严格限制治疗基因只在靶细胞中表达，避免治疗基因指导合成的蛋白质干扰非靶细胞的正常生活，产生毒副作用。
表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达。
要实现治疗基因的受控表达，必须建立完善的基因表达调控体系。基因调控策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。
一、基因内部的调节机制
（一）使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件
不同类型的正常细胞或组织中往往存在某些特有的蛋白质，它们的基因表达调控元件可用于驱动治疗基因的特异性表达，从而起到治疗作用。
例如，酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径中的一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。
前列腺特异性抗原(PSA)是参与精液凝块中蛋白质降解、使精液液化的一种丝氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中产生，而在前列腺癌细胞中含量很高，可以利用PSA基因调控元件驱动治疗基因在PSA阳性的前列腺癌细胞中表达而发挥作用，而其在PSA阴性细胞和非前列腺癌细胞中不能使治疗基因表达。
（二）使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件
某些病变的细胞或组织产生一些特殊的蛋白质，其基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。
例如，甲胎蛋白(AFP)基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达，不在成年肝脏细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中AFP基因异常激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因)在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成员，在许多腺癌细胞中含量很高，采用其启动子驱动治疗基因，可以使治疗基因只在CEA阳性的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达。此外，正在开展研究的这种类型的调控元件还有DF3(MUC1)启动子、HER-2/neu (erbB2)启动子和Myc-Max响应元件等。
二、基因外部的调节机制
除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达效果。
例如：采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性表达的目的。
又如：Egr-1基因是一种编码锌指转录因子的早期基因，包括电离辐射和细胞因子等在内的多种外部刺激都可以诱导其表达，将其调控序列启动的治疗基因(如肿瘤坏死因子基因)导入肿瘤组织，可在电离辐射等作用下，使治疗基因获得暂时性的局部表达，增强放疗效果，杀死肿瘤细胞。组织纤溶酶原激活物(t-PA)作为溶解血栓的药剂，在中风和心肌梗死等疾病治疗中起着重要的作用。在一些抗放疗的肿瘤中，t-PA的活性在辐射后竟然增加50倍，表明其基因表达调控元件中存在受辐射诱导的调控元件，故可利用其调控元件启动治疗基因的表达，增强放疗效果。
三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达
病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。
例如，在肿瘤病灶处，常常出现葡萄糖缺乏等情况，葡萄糖调节蛋白GRP78/Bip的含量也随之增加，使癌细胞能够抵御应激。当采用这种基因的启动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死。
在过度生长的肿瘤组织中，由于肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域，而缺氧条件可以通过缺氧诱导因子(HIF-1)和缺氧响应元件(HRE)相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件(HRE)来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。
机体发炎时所可产生的许多急性期蛋白，其基因的启动子可以控制发炎条件下治疗基因的表达；而一旦炎症消失，治疗基因的表达也随之终止。
四、治疗基因的诱导表达
采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些可诱导性基因表达系统。这种系统的必要成分有两种：一种是转录激活剂，它只在诱导药物存在时才能与DNA结合；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应。
目前较理想的可诱导的基因表达系统有四环素抗性操纵子系统。
原理：大肠杆菌四环素抗性基因的转录受到Tet阻遏蛋白的负调控，在没有四环素存在的条件下，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合从而阻断四环素抗性基因的表达；而当四环素存在的时候，由于阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，从而使四环素抗性基因的转录得以进行。基于上述原理所开发的Tet-off/Tet-on基因表达调控系统已成为基因治疗基础研究中的一种有效工具。
四环素抗性操纵子系统原理
四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控。
无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达；
四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。
图示四环素抗性操纵子系统工作原理
第六节&&基因治疗的应用研究
世界上第一个正式被批准用于基因治疗的病例是先天性腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症。1990年9月美国Blaese博士成功地将正常的人的ADA基因植入ADA缺乏症病人的淋巴结内，完成世界上首例基因治疗试验。在此后十几年中，基因治疗在临床上的试验和应用越来越多。
一、遗传病的基因治疗研究
已知人类有4000多种遗传病，在人群中的发病率约为40％～50％。但真正了解病因，能进行产前诊断的仅限于那些为数不多的常见遗传病。由于目前基因治疗的发展正处于起步阶段，对遗传病进行基因治疗的研究范围还十分有限，必须符合以下要求的遗传病才可以考虑开展基因治疗研究工作：
1.在DNA水平明确其发病原因及机制；
2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；
3.该基因的表达不需要精确调控；
4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞(如皮肤细胞，骨髓细胞等)中表达并发挥其生理作用；
5.该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述4条以上要求的不过只有30余种遗传病,如：腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症；珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病；血友病和其他血浆蛋白缺乏症；苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病；莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征；家族性高胆固醇血症；囊性纤维化病等。
二、恶性肿瘤基因治疗研究
肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生，如乳腺癌的发生至少与20个基因缺失有关。21世纪肿瘤的基因治疗将会在以下几个方面取得突破：
（1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；
（2）是抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；
（3）是增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；四是通过导入“自杀基因”杀伤癌细胞。
（一）肿瘤基因治疗的基本策略
从实际应用于临床治疗的角度来看，肿瘤基因治疗的策略包括：
(1)直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。
(2)增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤细胞。
(3)改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。
从基因操作的角度来看，肿瘤基因治疗则主要有四大策略，即基因修正、基因置换、基因失活和基因修饰。
基因修正：采用基因打靶技术纠正突变的抑癌基因中的突变序列；
基因置换：将外源性的正常抑癌基因直接导入肿瘤细胞，取代突变的抑癌基因发挥作用，以改变肿瘤细胞的恶性表型；
基因失活：利用基因干扰技术等抑制异常表达的癌基因或肿瘤相关基因，降低其表达活性或不表达；
基因修饰：将具有增强治疗效果的外源基因导入靶细胞，外源基因的表达产物可以修饰、改变靶细胞的功能或使靶细胞原有功能得到增强，其中包括自杀基因治疗、免疫基因治疗、药物敏感基因治疗和耐药基因治疗等多种方法。
（二）肿瘤基因治疗的常用方法
1．基因干预技术：通过基因干预，使得肿瘤细胞过度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶性表型。
2．自杀基因治疗—分子化疗：直接杀死肿瘤细胞。
3．肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。
4．提高化疗效果的辅助基因治疗： (1)药物增敏基因治疗； (2)耐药基因治疗。
（1）反义RNA技术：反义RNA的获得可通过体外构建反义RNA表达载体，导入肿瘤细胞表达反义RNA，也可体外合成反义RNA，导入靶细胞，直接对表达异常的癌基因产生抑制效应。
反义RNA技术治疗肿瘤的途径：（1）封闭异常表达的癌基因，如fos、neu、k-ras、c-src、c-myb和c-myc；（2）癌基因易位和重排部位是反义RNA治疗的靶点。费城染色体(phˊ) bcr-abl融合基因的连接处是反义封闭的最佳位置。（3）抑制肿瘤细胞耐药性，提高化疗效果。
（2）RNA干扰技术：RNA干扰技术可用于癌基因异常表达的恶性肿瘤基因治疗。利用RNA干扰技术可以阻断K-ras基因的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死bcr/abl表达的人白血病细胞系。通过RNA干扰技术可以抑制某些内源性基因的表达，促进白血病细胞的凋亡或增加其对化疗药物的敏感性。应用RNA干扰技术成功地阻断了乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因的功能。RNA干扰技术在恶性肿瘤的基因治疗中显示了美好的前景。
(3）反基因技术：
由于人工合成的TFO很容易被体内广泛存在的DNA酶降解，因此在使用前必须对其进行修饰。修饰主要针对反义寡核苷酸的磷酸骨架，可采用硫原子或甲基基团代替磷酸二酯中带负电的氧原子，提高对核酸酶的耐受力。TFO与HER-2原癌基因的启动子区域竞争性结合，抑制乳腺癌细胞中过度表达的HER-2基因。使用TFO也成功地抑制了Hela细胞中c-myc的转录。
2．自杀基因治疗：是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。
基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因，这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将转染了该基因的肿瘤细胞“自杀”。这些基因也相应地被称为“自杀基因”。
目前研究较多的“自杀基因”有单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)基因，它编码的胸腺嘧啶激酶可以将无毒的核苷类似物──丙氧鸟苷（ganciclovir,
GCV）磷酸化为细胞毒性物质。此外，还有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，它编码的酶可以将5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine, 5-FC）转化为细胞毒性药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）。
自杀基因治疗的前提条件是“自杀基因”的表达必须局限于肿瘤细胞中，而不伤及正常细胞。
自杀基因转移常用方法：①利用免疫脂质体、受体介导等技术进行定向基因转移。②根据肿瘤细胞和正常细胞分裂的显著差异，利用逆病毒载体不感染非分裂细胞的特点，进行基因转移。③肿瘤特异性基因转录。④肿瘤内直接注射。
“旁观者效应”（bystander effect）：不仅转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。这种效应明显扩大了“自杀基因”的杀伤作用，大大放宽了对基因转移效率的限制，对于自杀基因治疗的发展具有重要意义。
3．肿瘤的免疫基因治疗
肿瘤的免疫基因治疗是根据免疫学的理论和技术，并结合基因转移和基因表达调控等分子生物学方法，以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。主要包括细胞因子（或受体）基因治疗和抗原抗体基因治疗两大类。
4．提高化疗效果的辅助基因治疗：
临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：一是患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交差耐受，最终导致化疗失败。二则是大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。
(1)药物增敏基因治疗：
为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以考虑将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。
将鸡钙调素（calmodulin, CaM）基因导入小鼠乳腺癌细胞株C127，结果仅需低剂量的长春新碱或长春花碱即可明显抑制该细胞株的生长。对其作用原理进行研究后发现，CaM基因的表达产物作为细胞内信号传导系统的重要物质，明显增加了肿瘤细胞对长春新碱或长春花碱的吸收量而相应减少了排出量，从而提高了肿瘤细胞内化疗药物浓度，导致肿瘤细胞死亡。
(2)耐药基因治疗：
在解决化疗所致骨髓细胞造血功能受到严重抑制的问题方面，通过向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基因，如mdr-1基因等，以增强骨髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。
研究表明，肿瘤细胞耐药性的产生与多种糖蛋白或酶有关，包括多药耐药（mdr-1）基因编码的P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白（MRP）以及近年来发现的肺耐药相关蛋白等；还有细胞内氧化和解毒作用的酶系统，包括细胞色素P-450（cytochrome，P450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等等。
目前除了开发针对肿瘤细胞耐药性产生机制的拮抗剂，如用于阻断P-糖蛋白所引发多药耐药的戊脉安（verapamil）和用于阻断GSH合成的丁硫氨酸亚砜胺（BSO）等。还采用基因干扰技术，在基因水平阻断耐药基因的表达，使肿瘤细胞的多药耐药性丧失，从而易于被化疗药物杀死。
三、病毒性疾病的基因治疗研究
据统计，75%的人类传染病是由病毒引起的。病毒感染人体后不仅可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。同时，病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。有研究表明，它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病也存在一定的联系。迄今为止，临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，而在众多开展的抗病毒治疗方案中，抗病毒基因治疗十分引人注目。
1．调节机体免疫应答：
（1）将细胞因子(如干扰素、白细胞介素等)的基因，通过适当的载体导入机体免疫细胞，激活免疫细胞并促进其增殖分化，增强机体的细胞和体液免疫应答，促进机体清除病毒感染细胞和游离病毒。
（2）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，插入表达载体后直接导入机体，表达的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以引发特异性的细胞免疫应答，产生对野生致病病毒攻击的防御作用。
2．抗病毒复制：根据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计的，主要包括：
（1）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。
（2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。
（3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。
（4）RNA干扰技术。
（5）将抗病毒蛋白质基因，如2ˊ→5ˊ腺苷酸合成酶等基 因，导入机体细胞并持续表达，可以激活核酸酶F，降解病毒RNA，对RNA病毒的感染产生明显的抵抗作用。
四、其他疾病的基因治疗研究
神经退化性疾病（如帕金森氏病）:由于腺病毒可以感染有丝分裂后的细胞，同时具有潜在的高转导效率和在中枢神经系统免疫特惠区（immunologically privileged site）中的低病原性，因此是进行神经系统疾病基因治疗的有效载体。
已试验了两种传递治疗基因的主要策略：（1)重组载体的脑内直接注射；(2）采用取出体内细胞在体外经由载体转染修饰后回输脑内相关区域。
神经母细胞（neuroprogenitor）和人星型胶质细胞明显可以作为自体同源的细胞载体用于ex vivo修饰和扩张。使用四环素调节的腺病毒载体来表达酪氨酸羟化酶在若干动物模型中用ex
vivo技术表现出了可观的前景。在用脑衍生神经营养因子（BDNF）腺病毒重组体缓解亨廷顿疾病的实验过程中，发现在表达BDNF的大鼠模型中得到了可喜的结果。
小结：基因治疗的问题与展望
治疗基因调控元件的选择 ；
安全高效载体的构建和转移技术的选择；
靶细胞的选择 ；
七、思 考 题：
1.基因治疗的定义。
2.目前常用的基因治疗策略有哪些？
3．简述逆转录病毒载体的结构特点和生活周期。
4.何谓RNAi?它在基因治疗中有何突出优势？
5.简述目前用于肿瘤基因治疗的策略。
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