冻存的细胞复苏后一直问题不断。。。。郁闷中(细胞复苏,传代,培养基,漂浮) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 冻存的细胞复苏后一直问题不断。。。。郁闷中(细胞复苏,传代,培养基,漂浮)
摘要: [冻存的细胞复苏后一直问题不断。。。。郁闷中(细胞复苏,传代,培养基,漂浮)] 先是有类似小虫的东东在细胞上贴着，严重时引起细胞脱落。后来重新复苏了一管，细胞一开始很不错，1h后就全贴壁了，细胞上也很干净。第二天换了1次培养基，已经长的比较满了。由于担心细胞不够坚强，在复苏后第4天传代了，1传3。也是很快就贴壁了，可是传代第2天就觉得有些细胞漂了，当时认为是细胞不坚强的缘故，所以就轻轻的换了1次培养基，吸走了漂浮细胞；可是到传代第4天发现细胞有些变圆，细胞开始慢慢脱落。这次复 关键词:[传代 细胞复苏 培养基 漂浮]……
先是有类似小虫的东东在细胞上贴着，严重时引起细胞脱落。后来重新复苏了一管，细胞一开始很不错，1h后就全贴壁了，细胞上也很干净。第二天换了1次培养基，已经长的比较满了。由于担心细胞不够坚强，在复苏后第4天传代了，1传3。也是很快就贴壁了，可是传代第2天就觉得有些细胞漂了，当时认为是细胞不坚强的缘故，所以就轻轻的换了1次培养基，吸走了漂浮细胞；可是到传代第4天发现细胞有些变圆，细胞开始慢慢脱落。这次复苏并没有类似小虫的东东。唉，细胞养不好，试验没法做。。怎么办好呢？现在我还没找到原因，也不敢再复苏细胞了。。。。。。5
回复看了半天，都不知道你养的是什么细胞？回复这个问题我最近也遇到了，试验室复苏细胞刚开始还行（H1299），可过两天换液就发现有好多小虫子似的东西在里面游来游去，问实验室其它人说是黑胶虫污染，我在显微镜下看也像虫子，由于知道H1299细胞是被污染的，所以我十分的注意，结果我的hela也给污染了，怀疑是培养液的问题，本人就着实事求实的态度，做了以下实验，现将个人对黑胶虫的认识整理如下：实验过程：1 将无血清DMEM，胰酶，pbs,有血清DMEM，各两份铺于六孔板，其中一份中加入黑胶虫，放入孵箱，两天后观察2 同时将无血清DMEM，胰酶，pbs,有血清培养液各取100微升加入LB中，检测是否有细菌污染3 将一份加入黑胶虫的无血清的DMEM接入LB中，放入37度摇床。实验结果如下：1 两天后，我观察发现，在没有加黑胶虫的无血清DMEM，胰酶，pbs,有血清DMEM中，没有黑胶虫出现，也没有细菌污染，大家知道，细菌的繁殖能力超强不用一天，培养液就变黄了。说明我的无血清的DMEM，胰酶，pbs,有血清DMEM没有污染。这下又出现了另外一个问题，既然这几种液体没有问题，我的hela怎么会污染呢？因为我养hela时，污染的h1299已被我扔掉了，由于我同时将无血清DMEM，胰酶，pbs,有血清DMEM及一份加了黑胶虫的无血清DMEM放入了摇床，一天后我观察发现，只有加了黑胶虫的无血清DMEM颜色变混浊了，其它的没有变化，我继续让在摇床里摇。第二天，我又观察，发现胰酶里有细菌样的东西，我将胰酶取了少许滴在盖玻片上后在显微镜下观察，发现虫子了，至此，我明白了污染的来源，原来胰酶里面有这好东东！通过我的实验至少可以得出关于黑胶虫的以下几点结论：1
黑胶虫可以在无血清DMEM，胰酶，pbs,有血清DMEM中生长，不像上有的人说的黑胶虫的生长需要2
黑胶虫的生长与细胞是竞争的关系，细胞状态好，可能分泌某种物质抑制虫子的生长，如果细胞状态不好，虫子就疯长，细胞就慢慢死去3
虫子状态好时，是比较大的，在显微镜下能清晰看到其游动，虫子状态不好时，呈一小黑点，不游动，当然，这小黑点也可能是它的卵！4
过滤对其无作用，因为我的胰酶是刚从冰箱里拿出来的，它原来就潜伏在里面，我没有知道而已！以上是我的个人结论，希望大家提出意见！零分朋友，鼓励性加分回复先是有类似小虫的东东在细胞上贴着，严重时引起细胞脱落。后来重新复苏了一管，细胞一开始很不错，1h后就全贴壁了，细胞上也很干净。第二天换了1次培养基，已经长的比较满了。由于担心细胞不够坚强，在复苏后第4天传代了，1传3。也是很快就贴壁了，可是传代第2天就觉得有些细胞漂了，当时认为是细胞不坚强的缘故，所以就轻轻的换了1次培养基，吸走了漂浮细胞；可是到传代第4天发现细胞有些变圆，细胞开始慢慢脱落。这次复苏并没有类似小虫的东东。唉，细胞养不好，试验没法做。。怎么办好呢？现在我还没找到原因，也不敢再复苏细胞了。。。。。。51、第二次复苏的细胞既然已经贴壁生长，并且可以传代了，说明细胞复苏已经成功了，最起码不存在细菌、真菌之类肉眼可见的污染。2、传代后已经贴壁的细胞第二天漂起来，很有可能是培养箱内某些细胞外环境发生了变化，譬如说CO2浓度是否正确、CO2瓶中CO2是否不足、培养箱中的水是否已经蒸发完了而没有及时添加。3、如果说培养基是过年前配制的，最好重新测一次PH值，添加点谷胺酰胺。
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体外细胞的原代和传代培养以及冻存和复苏(正文)
体外细胞的原代和传代培养以及冻存和复苏
　　体外细胞的原代和传代培养，以及冻存和复苏　　一、实验原理　　细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养， 即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。　　细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高 细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方 法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。　　二、实验方法　　材料：　　小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养 液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱复苏：　　1.取出冷冻管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，移入无菌操作台内。　　2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。　　3.1000rpm离心10分钟，弃去上清液。　　4.加适当培养液后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
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编辑：丁倩
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细胞传统冷冻保存方法：
冷冻保存方法：
（1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟& -20℃30分钟& -80℃16～18小时（或隔夜）&液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。
（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5&106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
注意事项：
（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80&90％致密度。
（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
冻存用的实验耗材均在右侧边栏展现，如需订购，请联系。
下面是自行改良后的的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。
1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液
2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。
3. 适时去掉胰蛋白酶，加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。
4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。
5. 去上清液，加入与1ml的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀
6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
注意事项（个人总结）：
1．细胞冻存前应保证细胞的活力好，无污染；
2．冻存用90%的胎牛血清或者进口血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力
3.一定要保证DMSO的浓度是10%，冻细胞要舍得用进口的DMSO（我用的是SIGMA）
4.慢冻,快解冻。细胞在 -15 度左右胞内形成结晶对细胞损伤最大，缓慢降温有助于减少损伤，故放入 -20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便，保存时间过久会影响细胞活力。
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