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测序技术检测流产物拷贝数目变异的应用
余111蕾，杨国珍，程明亮，罗21新，夏曙华，王111碧，程树强，孙朝琴，简11单，王荔平
（1．贵阳医学院附属医院贵州省产前诊断中心，贵州贵阳．暨南大学附属第一医院，广东广州510630）
【摘要】目的：采用测序技术检测拷贝数变异，探讨测序技术在染色体疾病上的应用和拷贝数变异
在流产物检测中的应用价值。方法：选择2013年7月至2014年4月在贵阳医学院附属医院贵州省
产前诊断中心就诊孕妇中胚胎停止发育的50例患者，孕周为7～23周，留取流产物，提取DNA，制备
文库，高通量测序，对流产物DNA进行测序分析，得出流产物的拷贝数变异。同时对孕妇和流产物
做染色体核型分析。结果：50例孕妇的流产物染色体基因拷贝数变异检测，除1例为母源性污染，
未得出结果外，测序检出率78%，染色体核型检出率为28%。结论：测序技术检测流产物的检出阳
性率高于染色体核型检出率，流产物染色体核型能检出的整倍体改变、非平衡易位改变，测序技术均
能检出，且在染色体微缺失微重复检出上优于染色体核型检出，推荐临床上使用对流产物进行测序
技术检测查找流产原因。
【关键词】测序技术；拷贝数变异；染色体核型分析；流产物
中图分类号：Ｒ714.21文献标志码：A
TheApplicationofIlluminaSequencingTechnologytoDetecttheVariationof
Copy-numberintheAbortus
YULei，YANGGuozhen，CHENGMingliang，etal
（AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege，GuizhouProvincePrenatalDiagnosisCenter，GuiyangGuizhou
550000，China）
Correspondingauthor：YANGGuozhen
【Abstract】Objective：Toapplysequencingtechnologytodetectingthevariationofcopy-numberandexplore
theapplicationofsequencingtechnologyinchromosomaldiseasesandtheapplicationofvariationofcopy-number
detectinginabortus．Methods：50casesofpatientswithearlyembryonicdeathwithgestationalagebetween7
and23weeksfromGuizhouPrenatalDiagnosisCenterinAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollegefromJuly
of2013toAprilof2014wereselected．Thevariationofcopy-numberinabortuswasobtainedafterabortuscellec-
tion，DNAextraction，librarypreparation，high-throughputsequencingapplication，andperformingsequencingana-
lysesofDNAinabortus．Thechromosomalkaryotypeforpregnantwomenandabortuswasalsoidentified．Ｒe-
theabnormaldetectionrateofthevariationofcopy-numberwas78%viasequencingtech-sults：Inall50cases，
nology，comparedwith28%viachromosomalkaryotypesdetectionexceptonewithmaternalpollution．Conclu-
sions：Sequencingtechnologyismoresensitivethanchromosomalkaryotypesdetectionofthevariationofcopy-
numberinabortusespeciallyinchromosomemicro-deletionandmicro-duplication．Thistechnologyisrecommen-
dedtobeappliedtoclinical．
【Keywords】Sequencingtechnology；Variationofcopy-number；Chromosomekaryotypeanalysis；Abortus
流产为妇产科常见疾病，自然流产的病因十分复
杂，染色体异常、内分泌失调、血型不合、免疫因素、生
精神因素及母体的全身性疾病等都是其发殖器畸形、
生的重要原因。其中染色体异常在早期流产中占据
［1］很大比例。染色体异常包括染色体数目异常，如单
体、三体、多倍体；结构异常，如断裂、缺失、易位等。检出为5Mb左右。随着技术的发展，分辨率的影响，based芯片技术［微阵列比较基因组杂交技术（array-comparativegenomichybridization，array-CGH）或单核苷酸多态性微阵列技术（arraysinglenucleotidepoly-SNParray）］morphism，也成为最近几年新兴的一种检测方法，能将检出率提高，不过受限于其技术原理，芯
片探针无法覆盖的染色体区段将无法检测，这也限制
发现新的染色体畸变，进而限制了发现新的染色体疾对染色体异常的检测技术手段主要集中在染色体核型分析，然而染色体核型分析受细胞培养和核型显带
Email：@qq．com通讯作者：杨国珍，
实用妇产科杂志2015年9月第31卷第9期JournalofPracticalObstetricsandGynecology2015Sep．Vol.31，No.9
使得测病的可能。然而高通量测序技术的迅猛发展，
numbervaria-序技术用于染色体拷贝数变异（copy-tion，CNVs）检测的优越性越来越明显，我们采用测序技术检测拷贝数变异，探讨测序技术在染色体疾病上的应用和拷贝数变异在流产物检测中的应用价值。1
对象与方法
1.1对象2013年7月至2014年4月在贵阳医学院附属医院贵州省产前诊断中心就诊的胚胎停止发育的50例孕妇，年龄22～41岁，平均年龄31岁，孕周为7～23周，平均流产孕周11周。其中做试管婴儿孕
12例为复发流产，妇27例，初次自然妊娠11例，复发流产中流产2次的共计8例，其中1例为孕妇染色体
XX，inv9，1例为丈夫染色体核型为46，核型为46，
XY，Yq+，1例为丈夫染色体核型46，XY，15q+；流
产3次的3例，双方染色体正常，但其中1例曾经分娩过染色体核型为46Xt（Y；8）的患儿，该染色体变异为新发突变，患儿存在肛门闭锁、生殖器官异常、头颅、胸腔等畸形。流产5次的1例，孕妇染色体核
XX，t（4；22）。其余夫妻双方染色体核型正型为46，常。1.21.2.1
流产物拷贝数变异检测取流产物10mg，无
菌PBS缓冲液冲洗后，提取DNA，超声波打断，酶补齐，加接头A，构建测序文库。多个测序文库index标记后测序，测序采用美国Illumina公司型号为Hiseq2000高通量测序仪器进行检测。对测得的序列片段与已知人类参考基因组比对（hg19）进行数据分析。参照已发表研究中的FusedLasso算法确定染色
体片段的重复或缺失。在全基因组水平筛选出待检样本的DNA重复或缺失区域，并将检测数据与基
DGV）、因变异数据库（databaseofgenomicvariants，人类染色体变异数据库（databaseofchromosomalimbal-anceandphenotypeinhumansusingensemblresources，DECIPHEＲ）和在线人类孟德尔遗传数据库（online
Mendelianinheritanceinman，OMIM）进行匹配得出拷贝数变异的意义。1.2.2流产物、外周血染色体核型分析
1例母源性污染，50例流产患者，测序和染色体
核型分析均未成功，无结果；测序49例有结果，染色
体核型分析共计培养失败8例，其中3例核型分析培养失败，但测序结果显示正常。染色体核型检出14含非整例，检出率28%（14/50）；测序检出共计39例，倍体改变16例，见表1，拷贝数变异共计23例，测序检出率78%（39/50）。2.1
染色体非整倍体检出情况染色体核型和测序3号三体、4号三体、8号三体各1例，15号三结果中，
22号三体各3例，16号三体4例；1例45，X，1例体、
69，XXY，1例49，XY，+2，+7，+12/46，XY，见表1。染色体核型分析和测序的染色体非整倍体检测率分
32%（16/50）。别为28%（14/50），
流产物染色体非整倍体染色体核型和测序检测结果Chromosomeanalysisandsequencingofchromosomal
aneuploidinabortedtissues
染色体核型分析培养失败T16T15T22T4
49，XY，+2，+7，+12［18%］/46，XY［82%］69，XXY45，X
chr8：1－，T8chr16：1－，T16
chr15：2531392，T15chr22：304566，T22chr4：1－，T4chr3：1－，T3
chr2：1－，49，XY，+2，
+7，+12［20%］/46，XY［80%］69，XXYX45，
染色体基因组拷贝数变异检出情况拷贝数变
OMIM、DECIPHEＲ数据异检出共23例，查询DGV、
5例注释为各类缺失重复综合征，18例注释为多库，
态性或致病性未知。2.2.1
测序结果查询数据库注释为缺失或重复综
合征的5例，这5例微缺失微重复综合征染色体核型分析1例培养失败，其余4例染色体核型分析未检出异常，见表2。测序拷贝数变异的片段缺失有0.36Mb、3.24Mb、4.46Mb、18.38Mb、23.26Mb、40.82Mb，4.56Mb、23.88重复片断有1.23Mb、Mb。流产物染色体基因组拷贝数变异检测查询数据库注释为微缺失微重复综合征的检出率为10%（5/50）。
流产物、外周血样本接种（流产物采用常规消化法处
5%二氧化碳，37℃温箱培养，理），收获分离，滴片制G显带，片烤片，胰蛋白酶消化，吉姆萨染色，每例镜下计数30个核型，分析5个核型，嵌合体加倍计数，必要时做C带和N带。G带分辨率为320～400条带。
实用妇产科杂志2015年9月第31卷第9期JournalofPracticalObstetricsandGynecology2015Sep．Vol.31，No.9
染色体核型
分析培养失败未见异常未见异常未见异常未见异常
流产物染色体基因组拷贝数变异检测结果（微缺失微重复综合征）
例数（n）11111
Chromosomecopynumbervariationdetectionresultsofabortedtissues（chromosomalmicrodeletionsormicroduplicationsyndrome）
染色体基因组拷贝数变异检测
8p23.3p11.21（980000）×1，缺失片断大小为40.82Mb22q13.31q13.33（180000）×3，重复片断大小为4.56Mbchr16：（280000）×1，16p13.11重复片断大小为1.23Mb4p16.3p15.2（400）×1，缺失片段大小为23.26Mb4q32.3q35.2（－）×3，重复片断大小为23.88Mb12q11q12（340000）×1，缺失片断大小为0.36Mbchr6：（620000）×1，缺失片断大小为18.38Mbchr11：（860000）×1，缺失片断大小为3.24Mbchr4：（40）×1，缺失片断大小为4.46Mb
查询公共数据库结果注释
8号染色体缺失区域，与8p23.1缺失综合征相关
22号染色体重复区域，与22q13重复综合征相关16号染色体重复区域，与16p13.11重复综合征相关4号染色体缺失区域，与4P末端缺失综合征相关4号染色体重复区域，与4q末端重复综合征相关12号染色体重复区域，为多态性6号染色体长臂缺失综合征
11号染色体长臂的缺失通常无明显表型异常
4号染色体缺失区域，与4号染色体短臂末端亚端粒缺
HirschhornSyndrome）相关失综合征（Wolf-
染色体基因组拷贝数变异查询数据库注释为
多态15例，缺失或重复片段以2.38Mb为主，片段大变，发生在18例样本中，多数改变在同一样本中既有
缺失又有重复，染色体核型分析2例未培养成功，余未见异常，测在染色体水平的检测阈值内均未检出，序微缺失微重复检出率为36%（18/50）。
小0.44～2.62Mb；查询数据库界定为致病性未知的8例，片段大小0.1～1.26Mb，见表3。总共23种改
染色体号1号2号4号5号7号11号13号
流产物染色体基因组拷贝数变异检测结果（多态或致病性未知）
Chromosomecopynumbervariationdetectionresultsofabortedtissues（polymorphismorpathogenicunknown）
查询公共数据库结果注释1号染色体缺失区域，致病性未知2号染色体缺失区域，为多态性4号染色体缺失区域，致病性未知5号染色体重复区域，致病性未知7号染色体缺失区域，致病性未知7号染色体重复区域，致病性未知11号染色体重复区域，致病性未知13号染色体重复区域，致病性未知14号染色体缺失区域，为多态性
染色体核型
染色体基因组拷贝数变异检测
分析未见异常未见异常未见异常未见异常未见异常未见异常未见异常
1q41（－）×1，缺失片断大小为0.12Mb2q13（－）×1，缺失片断大小为0.50Mb4q21.3（260000）×1，缺失片断大小为0.10Mb5q21.2q21.3（－）×3，重复片断大小为1.12Mb7p11.2p11.1（020000）×1，缺失片断大小为0.40Mb7q11.1q11.21（160000）×3，重复片断大小为1.08Mb11p11.12（580000）×3，重复片断大小为1.26Mb13q13.2q13.3（620000）×3，重复片断大小为0.48Mb14q11.2（420000）×1，缺失片断大小为0.96Mb14q11.2（280000）×1，缺失片断大小为0.82Mb
14号未见异常
14q11.2（400000）×3，重复片断大小为0.94Mb14q11.2（440000）×3，重复片断大小为0.98Mb14q32.33（－）×3，重复片断大小为0.84Mb15q11.1q11.2（560000）×3，重复片断大小为2.38Mb15q11.2（560000）×3，重复片断大小为0.66Mb15q11.1q11.2（480000）×3，重复片断大小为1.94Mb15q11.1q11.2（800000）×3，重复片断大小为2.62Mb15q13.3（460000）×3，重复片断大小为0.44Mb15q11.1q11.2（q11.1q11.2（q11.1q11.2（q11.1q11.2（
－）－）－）－）
×1，缺失片断大小为2.36×1，缺失片断大小为1.74×1，缺失片断大小为2.16×1，缺失片断大小为2.28
14号染色体重复区域，为多态性
15号染色体重复区域，为多态性
15号未见异常
15号染色体缺失区域，为多态性
16号培养失败16p11.2（620000）×1，缺失片断大小为1.12Mb16号染色体缺失区域，为多态性
遗传变异是生命进化演变的基本特征。从细胞
DNA的变异主要包括染色体数目的变遗传学水平看，
异和染色体结构的变异。数目变异包括染色体组成
倍地增加或减少，以及单条染色体的增加或减少；结构变异主要指染色体片段的重复、缺失、倒位和易位
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liver fuction was 4.285% when
liver funtion worsened with HBV copies increasing ;
当病毒拷贝数在 10 5～ 10 6之间时 ,肝功能异常率为 4 .2 85 % ,HBV拷贝数增加肝功能也不同程度加重 ;
DNA copy number gains on chromosomes 3p,7q,8q,9q,and 10q were observed in 5-8F
5 - 8F染色体变化以 3p、7q、8q、9q和 10 q拷贝数增加为主 ;
DNA copy number gains on chromosomes 3p,7q,8q,9q,and 10q we re observed in 5-8F
5-8F染色体变化以3p、7q、8q、9q、和10q拷贝数增加为主;
RESULTS: In the 15 pairs of tissues, the most common chromosomal alterations were the gains of 3q, 8q, 6p, 20p, 5p, 18p, 2p, 2q and 1q, and the losses of 10p, 10q, 17p, 18q, 4p and 13q.
结果:最常见染色体DNA拷贝数增加的部位是3q,8q,6p,20p,5p,18p,2p,2q,1q; 常见的染色体DNA拷贝数丢失的部位是10p,10q,17p,18q,4p,13q。
Multiple Logistic Regression analysis showed that six month survive relative rate of patients with 1q gain was 10
fold higher than that of patients without 1q gain(β=2
经统计分析发现，在1q 拷贝数增加的病例中，其半年生存的相对机率比无1q 扩增的病例高10－5 倍（ 回归系数β＝ 2－35，P＜ 0－05） ；
0.8 and 1.2 were chosen as thresholds as theidentification of DNA copy number decreases (below 0.8) and increases (above 1.2).
比第三军医大学硕士学位论文值低于0.8有DNA拷贝数降低,大于1.2有DNA拷贝数增加。
It was shown that with the increase
of age,copy number of homologous sequence decreases.
结果　随着小鼠年龄的增加 ,同源序列的拷贝数减少。
A Modified Procedure for the Determination of the Gene Copy Number
基因拷贝数分析的研究
It increased the amoun
能增加大豆根瘤数;
Percentage of neutrophil in BAL increased.
且BAL中性粒细胞数增加。
Determination methods of plasmid copy number
质粒拷贝数的测定方法
查询“拷贝数增加”译词为用户自定义的双语例句&&&&我想查看译文中含有：的双语例句
没有找到相关例句 In this study the all fish gene(cMTsGH,common carp metallothionein and trout salmon growth hormone gene)
of the different form and copy numbers were microinjected into crucian carp fertilized eggs at different developing stages,to study their incubation rates.Foreign genes incorporated in the genome were tested by Dot blot and southern blot after the frys were hatched out.Meanwhile the integration rates of the fertilized eggs with chorion were compared
to those without chorion after microinjection.The results... In this study the all fish gene(cMTsGH,common carp metallothionein and trout salmon growth hormone gene)
of the different form and copy numbers were microinjected into crucian carp fertilized eggs at different developing stages,to study their incubation rates.Foreign genes incorporated in the genome were tested by Dot blot and southern blot after the frys were hatched out.Meanwhile the integration rates of the fertilized eggs with chorion were compared
to those without chorion after microinjection.The results showed that:1.The incubation rates were the highest at prophase and metaphase of one-cell,and
no significant difference from the control(P> 0.05).but there was very significant difference from other batches(P<0.01);2、The best time for microinjecting foreign gene into the fertilized eggs was at one-cell anaphase from incubation rate
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higher than that of the circular DNA.通过微注射法将不同构型和不同剂量的全鱼基因（ｃＭＴｓＧＨ，鲤鱼ＭＴ启动子与大麻哈鱼ＧＨ基因）导入不同发育时期的鲫鱼受精卵，研究其孵化率；孵出鱼苗后．通过斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，研究其整合率；并对受精卵去壳与未去壳导入全鱼基因后比较其整合率。结果表明：１显微注射外源基因后以单细胞前、中期孵化率最高．与对照组比差异不显著（Ｐ＞０．０５）．与其它组比较差异极显著（Ｐ＜０．０１）；２．综合孵化率与整合率．外源基因导入的最佳时期是受精卵单细胞后期；３．去壳卵与非去壳卵注射外源基因后整合率差异不显著．但孵化率有显著差异（０．０１＜Ｐ＜０．０５）；４、外源基因整合率随着注射ＤＮＡ拷贝数的增加而增大．孵化率则相反：５．线性ＤＮＡ整合率高于环形ＤＮＡ整合率。 Seventeen
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