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外周血单个核细胞的分离
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求助:外周血淋巴细胞的RNA提取
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求助:外周血淋巴细胞的RNA提取[转载]
我要做外周血淋巴细胞的RNA提取,请问我是采完血后一个一提呢,还是先冻存在液氮中,一起做?
冻存后会不会影响RNA的量?
请赐教. 查看完整版本请点击这里：
长发piaopiao ( 13:06:54)
这需要看你自己的情况,如果标本每次只有少数几个,而后续工作,如RT,或者其他,均已准备好,你抽一个做一个也无妨,但是从你的情况推测,你目前只是在收集标本,所以建议:采血后立即用液氮冷冻,然后可以在-70度冻存,直到你开始抽提RNA,这样不会影响RNA质量,当然,如果你采的血量多,可能多次抽提,那你最好在液氮冷冻前先分管装好,这样可以避免溶解血标本的需要.
丁香@@ ( 13:07:19)
谢谢您.还想问一下,用液氮冷冻时,是否加冷冻液?
是一直在液氮内放着好,还是然后放-70度冰箱里好?
笔笔 ( 13:07:43)
不用放冷冻液，直接放液氮里。冻好后再放-70即可。只要操作迅速（速冻细胞），RNA的质量就不会受影响。
8黑眼圈8 ( 13:10:04)
我的意见是可以先提出细胞（采血用EDTA或枸橼酸钾钠抗凝）来，再低温保存细胞，然后一起提RNA，再做其他如RT-PCR什么的
cute ( 13:10:50)
最好不要全血冻存，否则再溶解时容易导致溶血，影响淋巴细胞的分离。可以在分离出淋巴细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。若用TRIZOL试剂提取总RNA，可将TRIZOL加入淋巴细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。 这两种方法都不会影响RNA的质量，而且同一个一个提取标本相比，攒一批标本同时提取，可减少因提取标本造成的误差，实验结果更为准确。
cute ( 13:10:50)
最好不要全血冻存，否则再溶解时容易导致溶血，影响淋巴细胞的分离。可以在分离出淋巴细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。若用TRIZOL试剂提取总RNA，可将TRIZOL加入淋巴细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。 这两种方法都不会影响RNA的质量，而且同一个一个提取标本相比，攒一批标本同时提取，可减少因提取标本造成的误差，实验结果更为准确。
丁香@@ ( 13:12:18)
想问: 为什么要在淋巴细胞中加TRIzol后冻存呢?必须加吗?加多少?加完后再抽提RNA时怎么算TRIzol的量?,
另外,先冻在液氮,然后放在--70度冰箱.想问:一直放液氮里行吗?放在液氮多久算冻好了,然后放冰箱?
假小子 ( 13:12:44)
不作细胞培养时对细胞的冻存要求并不高，冻存前不加也行，但保存条件可能相应要高，因为要避免冻融过程对细胞的损伤影响RNA的质量。加TRIzol后，室温５分钟即可将细胞裂解，可能此时冻存缓冲能力高些吧，我不太清楚其原理，是我导师要求我这样做的，当时没考虑这么多。我当时放在－２０度冻存，如果时间相对较长，你可以考虑冻存在－８０度或－７０度，我个人认为如果不做细胞培养，仅提RNA的话，不必液氮冻存。加入的TRIzol的量可根据说明书计算一下，取决于你的细胞数的多少，一步加足，以后溶解后直接进行后续步骤即可。
还是孩子 ( 13:13:11)
我们实验室用全血提取PBMC做RTPCR,好多人全血都是肝素锂的抗凝管抽的血，做RTPCR 好像没有问题，为什么楼上有几位强调做RTPCR全血要EDTA 或者枸橼酸钠抗凝呢？我现在正在收集病人标本，希望有人将抗凝剂要这样讲究的道理说来听听。多谢了！
还是孩子 ( 13:13:11)
我们实验室用全血提取PBMC做RTPCR,好多人全血都是肝素锂的抗凝管抽的血，做RTPCR 好像没有问题，为什么楼上有几位强调做RTPCR全血要EDTA 或者枸橼酸钠抗凝呢？我现在正在收集病人标本，希望有人将抗凝剂要这样讲究的道理说来听听。多谢了！
阿拉蕾 ( 13:13:50)
肝素的影响有以下几点：
1、可能与肝素是一种带强负电荷的粘多糖硫酸酯有关，肝素能与细胞膜表面的膜蛋白，引起细胞膜表面的通透性改变。此外，肝素能结合并激活全血中多种蛋白酶原和补体系统，由此引起一系列酶学效应使DNA在提取过程中不断降解。
2、肝素会对PCR反应过程的强烈抑制作用，其原因是肝素有强大的负电荷，在全血DNA抽提过程中，不能被酚、氯仿祛除，亦不能被乙醇沉淀、洗涤祛除，从而不可避免的被带入PCR反应体系。通过以下途径影响：（1）肝素对DNA聚合酶有强大的亲合力，这样，DNA聚合酶就不能与Mg2+离子作用，形成正确的亲引物-模板复合体的活性中心；此外，有强大的负电荷的肝素与DNA聚合酶结合后，与同样带有较高负电荷的模板DNA之间产生排斥作用，从而使活性中心作用的空间位阻增大，这样，未活化或未充分活化的DNA聚合酶与引物-模板复合体低效率作用，使引物不能延伸或延伸不完全，势必对PCR造成影响；另外，细胞破碎，DNA抽提过程中肝素能与多种蛋白如低密度脂蛋白，多种酶原，补体等结合，并将这些蛋白带入PCR体系，导致PCR效率下降。（2）肝素影响PCR反应体系Mg2+离子的浓度，肝素有强大的负电荷，有较强的中和阳离子的能力，可与体系内的Mg2+、K+特别是Mg2+结合，使作为PCR反应体系DNA聚合酶的辅助因子的Mg2+浓度下降，从而使PCR效率下降或失败。
+田田+ ( 13:14:08)
我所知道肝素对RT－PCR的影响是（从老师那里听来的解释）：
肝素会影响RNA的完整性，这样如果我们需要全长的ｃDNA，用肝素抗凝肯定会影响结果，但在很多情况下，我们只是想检测某一段基因的表达，这样肝素对我们的影响就小多了，在多数情况下不会影响实验的进行。我们实验室至今都在用肝素抗凝PBMC，进行RT－PCR检测，未见有什么影响。
供你参考。
丁香@@ ( 13:14:30)
但我又有点疑问，如果用EDTA抗凝，EDTA也会螯合Mg2+，不也会影响DNA聚合酶活性吗？
Thank you anyway!
丁香@@ ( 13:14:53)
&你好，我现在急需提外周血淋巴细胞的RNA，想请教几个问题。
& 一，您是否用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞？分离后得到的是约一毫升外周血淋巴细胞悬液，在加TRIZOL之前是否要洗涤或再离心去掉其中的淋巴细胞分离液？
& 急需请求帮助，谢谢。如果有操作流程就更好
　回答如下:
是用淋巴细胞分离液,分离后的细胞直接加TRIZOL.流程如下:
丁香@@ ( 13:15:10)
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
　　测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
　　(一)　原理:
　　常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
　　(二)　方法:
　　1.　在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
　　2.　取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
　　3.　离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4.　用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMIrpm×10分钟，洗涤细胞两次。
　　5.　末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
　　单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
　　　　　　　　　4个大方格内细胞总数
　　　　　　　　　──────────　×　10４×2(稀释倍数)
　　　　　　　　　　　　　　4
　　6.　细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
　　　　　　　　　　　　　活细胞数
　　　　　活细胞百分率＝──────　×100％
　　　　　　　　　　　　　总细胞数
　　用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。　　
丁香@@ ( 13:15:26)
(三)　试剂和材料:
　　比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
　　Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋)
　　10％小牛血清RPMI1640
　　0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。
　　肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。
　　短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
　　无菌干燥注射器针头。
　　碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
　　血球计数板、显微镜、水平式离心机。
　　(四)　注意事项:
　　1.　抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
　　2.　操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
　　3.　用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
　　4.　小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
　　(五)　附录
　　1.　Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
　　　　NaCl 8.0克
　　　　KCl 0.4克
　　　　Na２HPO４·12H２O 0.12克
　　　　KH２HPO４　　　　　　 　　0.06克
　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　1.0克
　　　　双蒸水　　　　　　　　　 1000毫克
　　　　1％酚红液　　　　　　　　　 2毫克
　　将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
　　2.　细胞分层液配制法
　　　　9％聚蔗糖　　　　　　　　　24份
　　　　34％泛影葡胺　　　　　　　 10％
　　混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。
　　3.　磷酸缓冲液(P
　　A液: 0.2M NaH２PO４溶液
　　　　 NaH２PO４ 　　　　　　　　　　27.6克
　　　　 或NaH２PO４·2H２O 　　　　　　31.2克
　　　　 蒸馏水　溶解至　　　　　　　　1000毫升
　　B液：0.2M Ha２HPO４溶液
　　　　 Ha２HPO４·12H２O 　　　　　　71.6克
　　　　 蒸馏水溶解至1000毫升
　　各种不同PH值PB的配法
丁香@@ ( 13:16:04)
───────────────────────────────────────
　PH　　　　　7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液(ml) 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液(ml) 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
　　举例: 　0.1M 　PH7.2PB
　　　　　　A液　　　28毫升
　　　　　　B液　　　72毫升
　　　　　加蒸馏水　 100ml
　　4.　血球保存液
　　葡萄糖　　2.05克　枸椽酸钠　　0.8克
　　氯化钠　　0.42克　蒸馏水　　 100毫升
　　将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4℃保存备用。
　　5.　RPMI-1640培养液:
　　　　RPMT-1640(FLOW公司出品)　　　　1袋
　　　　三蒸水　　　　　　　　　　　 1000毫升
　　电磁搅拌30分钟：1N　HCl调PH7.2～7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4℃保存。
　　不完全RPMI-1640培养液:
　　　RPMI-1640　　　　　　　　　　　　　95毫升
　　　0.1M丙酮酸钠　　　　　　　　　　　　1毫升
　　 0.2M谷氨酰胺　　　　　　　　　　　　 1毫升
　　　1M　Hepes 1毫升
　　　7.5％ NaHCO３ 1毫升
　　　青霉素、链霉素(各1万单位)　　　　　　1毫升
　　完全RPMI-1640培养液
　　　不完全1640培养液　　　　　　　　　　90毫升
　　　灭活胎牛(或新生牛)血清　 　　　　　 10毫升
饭团团 ( 13:16:27)
我提动物的外周血淋巴细胞总RNA有一年多,原因是我从外周血淋巴细胞总RNA中调三个新基因,这方面我做的工作比较多,提一些建议仅供参考:
你可以采集抗凝血,肝素,EDTA 或者枸橼酸钠都可以选用,有的资料介绍肝素对后续的RT-PCR有影响,但我做的以及其它人的工作证明影响不大,有人用我提的RNA及反转录产物(cDNA)扩出了7个细胞因子基因和CD抗原,你说这家伙多省事和走运!
采集抗凝血之后立即用淋巴细胞分层液分离,取中间层乳白色淋巴细胞,再用HANK'S液洗两次,细胞沉淀加TROZOL混匀(约1-10×106cell加1mlLS TROZOL),注意从采血到加TROZOL的时间不宜超过4h,避免细胞死亡或细胞活性降低,这会影响某些基因的表达,不愿意马上提,可冻存于-70℃冰柜,至少1个月没问题.
值得强调的是,对于某些基因的扩增,应该用con A刺激培养外周血淋巴细胞24h在提总RNA,进行RT-PCR为好,许多文献都是这样做的.
具体方法你略查一下资料便知.
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十六 人类染色体分析：外周血培养制备染色体标本
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72小时是细胞分裂最旺盛的时间,这时候终止分裂,得到 的分裂相是最多的.
通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。用秋水仙素（细胞分裂阻断剂）积累分裂相，可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂...外周血染色体制作方法改进
外周血淋巴细胞一般情况下处于增殖周期中的G0(G1)期,当培养液中加入适量的植物血凝素(PHA)时,可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞,并呈分裂状态。秋水仙素的作用是使处于增殖周期中的分裂细胞停止在中期,因此秋水仙素的加入量和加入时间成为获得中期有丝分裂细胞的关键,常规染色体制备中一般细胞培养72 h,在收获细胞前4 h加入秋水仙素,细胞培养过程耗时长、繁琐、易交叉污染,能否通过改变秋水仙素的加入方法提早获得中期相的有丝分裂细胞,该方面的实验研究未见相关报道。本试验通过改进秋水仙素的加入量和加入时间,提前24~36 h获得观察结果,为染色体的制备提供了一个新的实验方法。1材料与方法1·1主要试剂培养液:取1袋RPMI-1640(日本产10·4g/袋)粉剂溶于950 ml三蒸馏水中,含15%的小牛血清和4%的PHA,用10%NaHCO3调pH至7·2,无菌室内0·22μm微孔滤膜滤过除菌,分装(5 ml/瓶),4℃冰箱保存。秋水仙素:取...&
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