&& 查看话题
PCR一直扩不出目的条带
各位大虾你们好：我想问一下我最近跑pcr一直扩不出我的目的条带，我退后温度从49度到60度都跑过还是没结果，我的引物合成单上的这对引物其中一条引物的Tm值是52.74，一条Tm值是55.02，我跑pcr的程序是95度2min，94度40s，55度40s，72度40s，循环35个，72度10min，4度保存。我的体系是模板2ul，dntp1ul，引物各1ul，buffer5ul，Taq酶1ul,DDW39ul，共50ul的体系。我的模板是提取的重组质粒！各位高手给小妹指点一下吧！谢谢了！
楼主的泳道里有弥散吗？质粒稀释多少倍？ 有弥散，隐约能看到拖带现象，另外在700bp还有条带，但是我的条带大小是300bp多，质粒的浓度不没测过！但是提完质粒检测条带可亮！ touch-dowm pcr试一下 质粒模板稀释100--1000倍后加1--5ul做模板，我这几次也这样，模板稀释后就扩出来了。另外检查下你的PCR试剂有没有问题 建议你做20ul体系试一下。 个人感觉不是体系的原因，我曾经遇到过N次这种情况，一次是因为两端引物浓度不一样造成的（看引物合成单上的OD值），一次是因为引物设计上有问题。楼主这个很明显退火温度已经不能再降了，已经出现非特异性扩增了；另外，你的buffer中加过MgCL2了吗？还有就是你的两端引物是不是太短了啊？加上保护碱基和酶切位点，Tm值才五十多？最后一个不明白的地方是，你的Taq酶加的好多啊（不过应该不会影响效果）！ 你可以尝试做一次20或25ul体系的，我一般都是做的25ul体系的 首先说个体外话：建议你换一个程序哦
你的变性、退火、延伸时间都太长了（300bp的片段延伸就算是高保真酶也只要10s就够了），你的程序太浪费时间了。
1、在做其他的尝试前，建议你先确认你的体系中各成分是否有被污染、有没有失效。
2、如果模板浓度非常高，降低点浓度试试；
3、两条引物的退火温度差异不大，不需要做TouchDown；但是建议你检查一下你的引物匹配程度，有无可能错配；要是都没问题，向引物合成公司投诉，要求重合。（有的时候出现双带甚至多带并不是因为你的引物设计有问题，而是合成公司做纯化、或者分装时压根就把引物给污染）。 : Originally posted by imyting at
个人感觉不是体系的原因，我曾经遇到过N次这种情况，一次是因为两端引物浓度不一样造成的（看引物合成单上的OD值），一次是因为引物设计上有问题。楼主这个很明显退火温度已经不能再降了，已经出现非特异性扩增了 ... 50ul体系加1ul 酶倒不算太多；具体还要看看酶活或者使用时间。有的时候酶放的太久或者保存不当导致酶活下降，多加点倒也没什么的。
但是要是很高，酶加多了真的会导致非特异性扩增哦~~~这个是我亲身经历的~~~ 我的引物TM值跟你的差不多，一条55.75，一条52.18，我把退火温度都降到50度了，才有目的带，但是我的不同样品结果差异很大，也在摸索……PCR产物为什么会出现100~200bp的条带我用菌落PCR检测library质粒扩增质量,引物用的是takara的M13正反引物,目的质粒基因长度为~500bp.PCR完后电泳图谱显示~750bp有较明显条带,很奇怪的就是100~200bp有_百度作业帮
PCR产物为什么会出现100~200bp的条带我用菌落PCR检测library质粒扩增质量,引物用的是takara的M13正反引物,目的质粒基因长度为~500bp.PCR完后电泳图谱显示~750bp有较明显条带,很奇怪的就是100~200bp有
PCR产物为什么会出现100~200bp的条带我用菌落PCR检测library质粒扩增质量,引物用的是takara的M13正反引物,目的质粒基因长度为~500bp.PCR完后电泳图谱显示~750bp有较明显条带,很奇怪的就是100~200bp有很明显的条带,共两条,类似于RNA,但从1.5ml的液体培养基中只取了3ul菌液进行菌落PCR,原菌中所带来的RNA应该不多,且PCR105℃的热盖也应将RNA降解掉了.200bp条带为何物,是如何来的?
你的目的片段长度为500bp,而你的电泳图谱显示是750你对电泳图谱750bp的片段是认可的,也就是说除去目的片段500bp,还有150bp的引物及其他序列；而你的杂带大小平均恰好是150bp,也就是除去150bp的引物及其他序列,应该不含有其他的DNA序列,因此判断你的150bp的条带就是引物二聚体造成的,如果条带非常亮的话,可以考虑减少引物的加入量.
可能是引物多聚物吧。。可以适量减少引物的量试试
引模二聚体 做PCR都会有的
也碰到了这种情况，搞得很是纠结你后来是怎么解决的？分享一下，谢谢RNA28S条带怎么大于2000bp_百度作业帮
RNA28S条带怎么大于2000bp
RNA28S条带怎么大于2000bp
总RNA含量约占80％的rRNA.完整的总RNA样品应具有三个频段,分别为28S rRNA基因,18S rRNA基因,5S rRNA基因.在亮度28S rRNA的条带的18S rRNA条带应约2倍的亮度,这表明了比较完整的RNA样品,几乎没有下降.相反,如果两个频带的亮度,然后将RNA样品降解发生.如果荧光区或点状槽槽的附近,则表示该RNA样品中的DNA污染.纯度分析：其OD260 / OD280比纯RNA样品应该是1.7至2.0,低于这个比例说明了蛋白质或酚污染,如果该比率大于2.0,可以污染异硫氰酸胍; OD260 / OD230的比值应大于2.0更大,如果该比率小于该小分子和它的盐中描述的污染.逆转录通过RNA和RNA的要求做比赛双方的高纯度约1微克和浓度.}