RNA电泳图 帮忙分析_百度知道
RNA电泳图 帮忙分析
RNA为建cDNA库用跑出3条带，但是18s带更亮更宽，28s不够亮条带比较sharp，不像有拖带的样子做了好几遍都是这样，请问是28s降解的原因吗?还是其他原因？这样的样品可以用来提MRNA做RT PCR吗？不胜感激！！
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应该是28s降解了的原因。
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出门在外也不愁用大肠杆菌表达蛋白时,要确定是上清还是包涵体表达,为什么沉淀里的包涵体不需要用尿素溶解就可以跑电泳我不明白这段话中的一些意思：“先破碎细胞,离心,沉淀和上清分别跑电泳,看看_百度作业帮
用大肠杆菌表达蛋白时,要确定是上清还是包涵体表达,为什么沉淀里的包涵体不需要用尿素溶解就可以跑电泳我不明白这段话中的一些意思：“先破碎细胞,离心,沉淀和上清分别跑电泳,看看
用大肠杆菌表达蛋白时,要确定是上清还是包涵体表达,为什么沉淀里的包涵体不需要用尿素溶解就可以跑电泳我不明白这段话中的一些意思：“先破碎细胞,离心,沉淀和上清分别跑电泳,看看目的蛋白在包涵体中还是在裂解上清中.若在包涵体中,先洗涤包涵体,然后再用8M尿素或者6M盐酸胍溶解包涵体.”主要想问,为什么用沉淀跑电泳可以确定目的蛋白是否在包涵体中呢?包涵体不是要溶解的吗,不溶解的话质量应该很大吧（因为包涵体里有很多蛋白）,质量大的话怎么可以用电泳来确定呢?电泳的原理就是根据蛋白质量大小来将不同的蛋白分开的呀?首先，我知道什么是包涵体。第二，我没有说质量大不可以跑电泳。第三，我知道不同种电泳的原理各不相同。我对生物技术算不上十分精通，但这点常识还是有的。我只想问，第三点中说“上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了”，为什么上样缓冲液可以让包涵体解聚？
1）你应该是没有明白什么是包涵体,简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的,主要的是疏水作用.实际上就是很多个蛋白分子,这些蛋白并不是交联在一起的,用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性,解聚.2）用沉淀跑电泳可以确定目的蛋白是否在包涵体?包涵体是不溶于水的,比较总蛋白.沉淀,及上清中的诱导带就可以知道上清中有没有你想要的可溶蛋白了3）电泳检测的话,可以用SDS-PAGE检测,在上样之前,需要用上样缓冲液处理样品,处理后,包涵体也就解聚了,每个蛋白分子与SDS结合,形成了可溶物.4）质量大的话怎么可以用电泳来确定呢?为什么不可以呢?DNA电泳,蛋白电泳不都可以吗?5）电泳的原理就是根据蛋白质量大小来将不同的蛋白分开的呀?不通种电泳的原理个不相同.SDS-PAGE可以简单的认为是根据蛋白质量来区分蛋白的.你想不明白应该是不知道什么是包涵体,或者什么是电泳,电泳的原理,你自己还是在网上好好看看这些内容,应该不难理解.上样缓冲液中有巯基乙醇,SDS,样品还要加热,破坏了包涵体之间蛋白的相互作用力,最好还是看看是怎么行成的包涵体吧
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SDS-PAGE电泳、western blotting 过程中常见问题以及解决方法
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00:46:37&&&来源：&&&评论：&&
[sds page问题，求助大神！] 做了很多次page。每次空白跑出来和目的菌一样的，根本找不到目的条带，仪器是biorad电泳仪。目的蛋白大约为37kd。条件如下：1.从含目的质粒的原始菌株接种到LB固体培养基，过夜培养，取单克隆接种到2ml LB液体培养基中，过夜培养。作母液。将空白菌接种到不含氨苄的培养基中，过程同前。氨 关键词:[上清 条带 质粒 化学发光 接种 菌体 肌钙蛋白 目的条带]…
做了很多次page。每次空白跑出来和目的菌一样的，根本找不到目的条带，是biorad电泳仪。
目的蛋白大约为37kd。
条件如下：
1.从含目的质粒的原始菌株接种到LB固体培养基，过夜培养，取单克隆接种到2ml LB液体培养基中，过夜培养。作母液。将空白菌接种到不含氨苄的培养基中，过程同前。氨苄浓度100ug/ml。
2.将母液以1:50 加入2ml液体培养基中，过夜培养，加入1mM的iptg。继续培养6小时左右。因为科室没有摇床，都是静置培养。
3.一共培养了七管，一管没加IPTG，其余六管加IPTG浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0（单位mM）。
4.菌体经12000转离心十分钟，弃上清，PBS清洗两次，加入80ulPBS重悬，在加入20ul 5X上样缓冲液。100°沸水煮5分钟。12000转离心十分钟。
5.分离胶缓冲液1.5mmol/L Tris-Hcl（Ph8.8）：18.15gTris和48ml1mmol/L Hcl混合。加水稀释至100ml终体积。室温保存。
浓缩胶缓冲液0.5 mmol/L Tris-Hcl（Ph6.8）：6.05gTris溶于40ml蒸馏水中，用约48ml 1mol Hcl调制ph 6.8.加水稀释至100ml。
Tris-甘氨酸电泳缓冲液：3.03gTris、18.8g甘氨酸、1gSDS用蒸馏水溶解后定容至1L。
考马斯亮蓝染液：0.5g G250考马斯亮蓝溶于100ml甲醇，加入20ml冰乙酸，蒸馏水定容至200ml。
脱色液：250ml甲醇+50ml冰乙酸+700ml蒸馏水
6.清洗1.5mm玻璃板，清洗架子，清洗电泳槽，晾干待用。
12%分离胶(10ml) 4%浓缩胶(5ml)
蒸馏水 3.3ml 3.4ml
丙烯酰胺 4.0ml 0.83ml
缓冲液 2.5ml 0.63ml
10%SDS 0.1ml 0.05ml
10%AP 0.1ml 0.05ml
TEMED 4ul 5ul
7.取上清20ul上样。先用80v电压跑30分钟，然后用120v电压跑一个半小时左右，知道所有的上样缓冲液跑出，然后停止，小心切胶，将胶放入考马斯亮蓝染色液染半个小时，然后用脱色液脱色。跑出来如图.目标菌的条带与空白一样，再者IPTG好像没起作用，但是上清用化学发光法测定有高浓度的目标蛋白。已经做了很多次，不知道什么原因。请各位大侠帮帮忙。
1.空白（不含目的质粒）2.目标菌（没加IPTG）3-8目标菌（分别加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mMIPTG）回复
”上清用化学发光法测定有高浓度的目标蛋白“， 是用特异性抗体做的WB吗？
如果上清用western blot做出来了，建议用TCA或者硫酸铵将上清沉淀后，再跑电泳。
有抗体的话做个western把，cbb条带太多，分不清的。
这种问题很常见，可能有几个原因：
1.你的质粒构建有问题，可能有突变等什么原因，不知你构建成功后有没有测序验证？
2.你的质粒在你的诱导条件下不表达，部分蛋白不知什么原因不表达或表达量太低，导致很难肉眼观察到。
你可以向某些战友说的用western检测，也可以直接用亲和柱强行纯化，看能不能得到蛋白。
如果能检测到微量表达，你可以尝试不同培养条件，宿主细胞、载体等，增加蛋白的表达。
1，电泳跑的不错，条带清晰；
2，没有摇床静置培养，即使所有的其它的东西都是正确的，表达肯定不会好的；
3，“但是上清用化学发光法测定有高浓度的目标蛋白。”你这个上清是什么上清？跑电泳的上样液？还是培养的物的上清？如果是后者，该是分泌表达，你拿菌体破碎物做出电泳条带，那才奇怪。如果是前者——你电泳上样的样品不是菌体用Loading buffer悬浮煮沸的吗？怎么做化学发光？
4，“做了很多次page。每次空白跑出来和目的菌一样的，根本找不到目的条带，是biorad电泳仪。
目的蛋白大约为37kd。
条件如下：
1.从含目的质粒的原始菌株接种到LB固体培养基”
是不是应该写成：……每次目的菌跑出来和空白菌一样……将含目的质粒的原始菌株接种到LB固体培养基”。呵呵
如果表达量很低的话看不到条带是正常的, WB显示有表达的话可以直接摇500ml菌液尝试纯化。
如果用8%的胶的话, IPTG诱导后的泳道里应该能看到230kDa的半乳糖苷酶条带，有的话就表示诱导没问题。
1，电泳跑的不错，条带清晰；
2，没有摇床静置培养，即使所有的其它的东西都是正确的，表达肯定不会好的；
3，“但是上清用化学发光法测定有高浓度的目标蛋白。”你这个上清是什么上清？跑电泳的上样液？还是培养的物的上清？如果是后者，该是分泌表达，你拿菌体破碎物做出电泳条带，那才奇怪。如果是前者——你电泳上样的样品不是菌体用Loading buffer悬浮煮沸的吗？怎么做化学发光？
4，“做了很多次page。每次空白跑出来和目的菌一样的，根本找不到目的条带，仪器是biorad电泳仪。
目的蛋白大约为37kd。
条件如下：
1.从含目的质粒的原始菌株接种到LB固体培养基”
是不是应该写成：……每次目的菌跑出来和空白菌一样……将含目的质粒的原始菌株接种到LB固体培养基”。呵呵
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1.谢谢！我是新手，基本没经验，都靠自己摸索在搞。
2.没办法。临床的就是这么悲催，毕业论文。科室条件简陋。
3.上清是我裂解离心菌体后得到的上清，沉淀用PBS溶解。我做的是肌钙蛋白T，用罗氏化学发光测上清和沉淀都能测到高浓度的肌钙蛋白T，空白菌测出来的有肌钙蛋白T，但浓度很低，但每次跑出来都和空白菌差不多。没有找到多出的条带。怀疑产生包涵体，我也试过用8M尿素溶解过沉淀，跑出来在37KD附近的条带深一些。如下图，第二、第三泳道是空白菌，第二泳道是空白菌沉淀，第三泳道是空白菌上清，第四泳道是目标菌沉淀用8M尿素溶解。
4，呵呵，我没怎么仔细看，大概是那么个意思。
这种问题很常见，可能有几个原因：
1.你的质粒构建有问题，可能有突变等什么原因，不知你构建成功后有没有测序验证？
2.你的质粒在你的诱导条件下不表达，部分蛋白不知什么原因不表达或表达量太低，导致很难肉眼观察到。
你可以向某些战友说的用western检测，也可以直接用亲和柱强行纯化，看能不能得到蛋白。
如果能检测到微量表达，你可以尝试不同培养条件，宿主细胞、载体等，增加蛋白的表达。
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1.质粒是别人帮我构建的，经过了测序验证。他也将质粒转进细菌做过预实验，可以清晰的看到目的条带。
2.这个我也觉得有可能，是不是有可能正好和目的蛋白重叠了，导致掩盖了目的条带？我的质粒是加了HIS标签,买了QIAGEN公司的HIS-TAG纯化盒，活性条件下纯化的不好，很郁闷。我现在正在尝试变性条件下纯化，不知道怎么样，今天才跑了PAGE，明天早上去看结果。如果不行，我这周再坐下western。没有其他办法了。
3.非常感谢你。
有的话做个western把，cbb条带太多，分不清的。
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恩，谢谢，我准备坐，只是二抗还没到，cbb是什么？
”上清用化学发光法测定有高浓度的目标蛋白“， 是用特异性做的WB吗？
如果上清用western blot做出来了，建议用TCA或者硫酸铵将上清沉淀后，再跑电泳。
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我做是肌钙蛋白T,上清是我用菌体裂解后得到的，沉淀和上清是罗氏化学发光法都能的都很高的肌钙蛋白T。
western还没做，准备这周做下试试。硫酸铵沉淀上清？是直接加在上清里面吗？
如果表达量很低的话看不到条带是正常的, WB显示有表达的话可以直接摇500ml菌液尝试纯化。
如果用8%的胶的话, IPTG诱导后的泳道里应该能看到230kDa的半乳糖苷酶条带，有的话就表示诱导没问题。
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用过100ml培养，但跑出来还是差不多，只是条带变深了，纯化做了，HIS的标签，纯化不好，正在摸条件。
8%的胶，那那条带有什么特别的吗?谢谢啊
用过100ml培养，但跑出来还是差不多，只是条带变深了，纯化做了，HIS的标签，纯化不好，正在摸条件。
8%的胶，那那条带有什么特别的吗?谢谢啊
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37kDa的蛋白用8%-10%的分离胶足矣，12%的话大分子挤在一起看不清楚。如果看不到230kD出现一个很细的条带的话就是培养条件的问题。
仔细看了一下主贴，没有这也太惨了，估计很难做出结果。
恩，谢谢，我准备坐，只是还没到，cbb是什么？
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CBB就是考马斯亮蓝的英文。
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