2007年我国科学家率先完成了家蚕基因组精细图谱的绘制，将13000多个基因定位于家蚕染色体DNA上．请回答以下有关家蚕遗传变异的问题：（l）在家蚕的基因工程实验中，分离基因的做法包括用对DNA进行切割然后将DNA片段与结合成重组DNA，再将重组DNA转入大肠杆菌进行扩增等．(2）家蚕的体细胞共有56条染色体，对家蚕基因组进行分析（参照人类基因组计划要求），应测定家蚕条双链DNA分子的核苷酸序列．(3）决定家蚕丝心蛋白H链的基因编码区有16000个碱基对，其中有1000个碱基对的序列不编码蛋白质，该序列叫；剩下的序列最多能编码个氨基酸（不考虑终止密码子），该序列叫．(4）为了提高蚕丝的产量和品质，可以通过家蚕遗传物质改变引起变异和进一步的选育来完成．这些变异的来源有：．（5）在家蚕遗传中，黑色（B)与淡赤色（b）是有关蚁蚕（刚孵化的蚕）体色的相对性状，黄茧(D）与白茧（d）是有关茧色的相对性状，假设这两对性状自由组合，杂交后得到的子代数量比如下表：亲本子代黑蚁黄茧黑蚁白茧淡赤蚁黄茧淡赤蚁白茧组合一9331组合二0101组合三3010①请写出各组合中亲本可能的基因型组合一组合二组合三②让组合一杂交子代中的黑蚁白茧类型自由交配，其后代中黑蚁白茧的概率是（）。-乐乐题库
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2007年我国科学家率先完成了家蚕基因组精细图谱的绘制，将13000多个基因定位于家蚕染色体DNA上．请回答以下有关家蚕遗传变异的问题：（l）在家蚕的基因工程实验中，分离基因的做法包括用对DNA进行切割然后将DNA片段与结合成重组DNA，再将重组DNA转入大肠杆菌进行扩增等．(2）家蚕的体细胞共有56条染色体，对家蚕基因组进行分析（参照人类基因组计划要求），应测定家蚕条双链DNA分子的核苷酸序列．(3）决定家蚕丝心蛋白H链的基因编码区有16000个碱基对，其中有1000个碱基对的序列不编码蛋白质，该序列叫；剩下的序列最多能编码个氨基酸（不考虑终止密码子），该序列叫．(4）为了提高蚕丝的产量和品质，可以通过家蚕遗传物质改变引起变异和进一步的选育来完成．这些变异的来源有：．（5）在家蚕遗传中，黑色（B)与淡赤色（b）是有关蚁蚕（刚孵化的蚕）体色的相对性状，黄茧(D）与白茧（d）是有关茧色的相对性状，假设这两对性状自由组合，杂交后得到的子代数量比如下表：亲本子代黑蚁黄茧黑蚁白茧淡赤蚁黄茧淡赤蚁白茧组合一9331组合二0101组合三3010①请写出各组合中亲本可能的基因型组合一组合二组合三②让组合一杂交子代中的黑蚁白茧类型自由交配，其后代中黑蚁白茧的概率是（）。限制酶（或限制性内切酶）运载体（或质粒）&&（2）29&
本题难度：一般
题型：解答题&|&来源：2009-生物的变异
分析与解答
习题“2007年我国科学家率先完成了家蚕基因组精细图谱的绘制，将13000多个基因定位于家蚕染色体DNA上．请回答以下有关家蚕遗传变异的问题：（l）在家蚕的基因工程实验中，分离基因的做法包括用对DNA进行切割然后将D...”的分析与解答如下所示：
考查了基因工程、遗传变异的相关内容。通过基因工程获得目的基因的途径有：鸟枪法、反转录法和人工合成法。最简单的方式是用限制酶对DNA进行切割获得目的基因。将获得的DNA片段与载体结合，得到重组DNA后，再导入受体细胞。家蚕是ZW性别决定，含有Z、W两条性染色体，所以在对家蚕基因组进行分析时应分析27条常染色体核2条性染色体（Z、W染色体）。家蚕的基因分为编码区和非编码区，编码区又有内含子和外显子之分，其中外显子能编码氨基酸，由此可知丝心蛋白H链的基因编码区有16000个碱基对，其中有1000个碱基对的序列不编码蛋白质，能编码氨基酸的个数为（）/3=5000个。对家蚕而言可遗传的变异来源有三个：基因突变、基因重组和染色体变异。组合一：根据后代性状比为黑蚁：淡赤蚁=3：1；黄茧：白茧=3：1，说明了双亲控制两对相对性状的基因组合均为杂合体，即双亲组合基因型BbDd(或BbDd×BbDd)。组合二：根据后代性状比为黑蚁：淡赤蚁=1：1；后代只有白茧一种性状，说明了双亲控制体色基因组合是Bb、bb，而茧色只有一种基因组合：dd,即双亲组合基因型BBdd、bbdd(或BBdd×bbdd)。组合三：根据后代性状比为黑蚁：淡赤蚁=3：1，说明了双亲控制体色基因组合均是Bb；而茧色全为黄色说明了双亲之一必为纯合体DD，由此可推知双亲的基因组合为BbDD、BbDd、Bbdd(或BbDD×BbDD、BbDd×BbDD、BbDD×Bbdd)。组合一中黑蚁白茧的基因型为BBdd和Bbdd,其中前者占1/3，后者占2/3。它们自由交配随即组合：BBdd×BBdd、２（BBdd×Bbdd）、Bbdd×Bbdd将这三种组合产生黑蚁白茧的概率相加即可。或得出淡赤蚁出现的概率，也可得黑蚁白茧的概率。
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2007年我国科学家率先完成了家蚕基因组精细图谱的绘制，将13000多个基因定位于家蚕染色体DNA上．请回答以下有关家蚕遗传变异的问题：（l）在家蚕的基因工程实验中，分离基因的做法包括用对DNA进行切...
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染色体变异与育种
与“2007年我国科学家率先完成了家蚕基因组精细图谱的绘制，将13000多个基因定位于家蚕染色体DNA上．请回答以下有关家蚕遗传变异的问题：（l）在家蚕的基因工程实验中，分离基因的做法包括用对DNA进行切割然后将D...”相似的题目：
小麦的高秆（D）对矮秆（d）显性，抗病（E）对易染病（e）显性，且这两对基因位于不同的染色体上，下图为利用纯合高秆抗病小麦与矮秆易染病小麦快速培育纯合矮秆抗病小麦图，下列叙述不正确的是&A．进行①过程的主要目的是让控制不同优良性状的基因组合到一起B．②过程中发生了非同源染色体的自由组合C．实施③～④过程育种依据的原理是染色体变异D．④过程用一定浓度的秋水仙素处理萌发的种子和幼苗
农业科技人员做了两个实验（1）用适当浓度的生长素溶液处理末授粉的番茄花蕾子房，获得无籽番茄。（2）用四倍体西瓜与二倍体西瓜杂交，获得三倍体西瓜植株，给其雌蕊授以二倍体西瓜花粉，子房发育成无籽西瓜。下列有关叙述正确的&&&&上述无籽番茄性状能遗传若取无籽番茄植株无性繁殖，长成的植株所结果实中有种子上述无籽西瓜无性繁殖后，无籽性状不能遗传若取上述无籽西瓜无性繁殖，长成的植株子房壁细胞含有4个染色体
下图是用农作物①和②两个品种分别培养出④⑤⑥⑦四个品种的过程。 A、a和B、b、D为基因，且A、a和B、b分别位于两对同源染色体上。下列说法错误的是A．Ⅲ过程使用了基因工程技术B．培养品种④的途径中，Ⅰ→Ⅳ→Ⅴ比Ⅰ→Ⅱ途径所用的时间短C．从目前的操作过程看，④培育成的⑤品种中新增加的基因不只是DD．Ⅴ过程与Ⅱ过程的原理相同
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数学方法在蛋白序列分析中的应用
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3秒自动关闭窗口编码甜蛋白的dna序列及生产该蛋白质的方法
专利名称编码甜蛋白的dna序列及生产该蛋白质的方法
技术领域本发明涉及用DNA重组技术生产应乐果甜蛋白(monellin)，特别是涉及人工合成的编码应乐果甜蛋白的DNA序列，含有该DNA序列的重组载体，携带该重组载体的原核生物宿主细胞以及使用所说的重组体原核细胞生产应乐果甜蛋白的方法。
食品工业所用的糖类甜味剂也是人体内代谢的主要能源物质，为各种生理活动提供能量，而多余的糖类化合物则在体内代谢过程中转变成脂肪贮存起来。高蛋白-低脂肪这一食品营养结构发展趋势促进了不含糖类化合物的蛋白质甜味剂的研究。甜蛋白的甜度极高，相同分子数的甜蛋白比蔗糖的甜度约高十万倍。因而其作为甜味剂时用量极低。另外，该物质在化学本质上属于蛋白质，一般不含任何碳水化合物。与蔗糖葡萄糖或果糖等甜味剂相比，代谢产生的热量很少，因此特别适用于糖尿病、肥胖病、儿童龋齿病和心血管病人食用。这些特点，使它在未来的食品、饮料、医药、饲料等工业中都具有应用价值。目前已经报道了许多种不同的甜味蛋白质，如奇异果甜蛋白(thaumatin)(Wagner WJ.，Sharp JA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(3)81)、应乐果甜蛋白(monellin)(Ogata，C.，Hatada，M.，Nature ，1987)、仙茅甜蛋白(curculin)(Yamashita H.，Theerasilp S.，TheJournal of Biolo.Chem.265(26) 1990)、Miraculin(Theerasilp S.，Kurihara Y.，J.Biolo.chem.263(23) 1988)、马槟榔甜蛋白(mabinlin)(胡忠和何敏，马槟榔甜味蛋白的研究，云南植物研究5(2)207-212，1983)。
应乐果甜蛋白是存在于一种西非植物(DioscoreophyllumComminisii)的果实(Serendipity Berries)汁液中的一种强力甜味蛋白质。同等重量的应乐果甜蛋白的甜度大约是蔗糖的倍。如果以摩尔数为基础进行比较，则其甜度约为蔗糖的10万倍(Kim，S-H.，deVos A.M.，Trendsin Biochem.Sci.8)。近年来，已对应乐果甜蛋白进行了大量的研究，关于这种蛋白质一级结构的氨基酸序列及其三级结构都已十分清楚(Ogata，C.，Hatada，M.，Nature ，1987)。
天然的应乐果甜蛋白是一种分子量为10700道尔顿的小蛋白，分子由A、B两条肽链靠非共价键，主要是氢键结合。A链有44个氨基酸，B链有50个氨基酸，分子内无二硫键。X-射线晶体衍射分析表明，该蛋白的分子结构相对紧密，分子内没有大的环状结构。一个β折叠片由5个β-构象的肽链构成，其中2个来自于B链，3个来自于A链。每个β-构象的肽链约有10个氨基酸。一个α-螺旋位于β-折叠片的凹部。分子借助于两条链之间的氢键和疏水键使其结构得以稳定。
如前所述，应乐果甜蛋白有很大的产业应用价值，因此，利用分子生物学和DNA重组技术，深入研究以高产率生产这种蛋白质甜味剂的方法，对于进一步开发利用这种新型蛋白质甜味剂及实现其工业化生产具有重要意义。
当然可以直接从其来源植物(DioscoreophyllumCommini-sii)的果实中提取这种蛋白质。但由于原材料的不易获得而使其工业应用受到限制。有人通过固相合成蛋白质的方法，直接分别合成应乐果甜蛋白的A、B两条肽链，然后组织成有活性的甜蛋白(日本专利JP 5070494)。但这种方法的成本很高，也难以进行工业化生产。
随着分子生物学的发展及其实验技术的日趋完善，人们开始尝试通过应乐果甜蛋白基因的克隆和表达，来获得这种蛋白质。Kim等人设计了一段连接DNA序列，将应乐果甜蛋白的A、B两条链的DNA编码序列连接起来，构建了一个能表达出一条单链甜蛋白的应乐果甜蛋白基因，这种改造后的甜蛋白的稳定性和复性能力都有所提高，而且未影响它的甜味活性(Sung-HouKim，Chul-Hee Kang，Protein Engineering )。Myany等人也设计合成了应乐果甜蛋白基因，并使之在酵母中表达，但表达的效率都并不十分理想(国际专利WO90/07580)。
大肠杆菌繁殖速度快，适合做基因克隆表达的受体宿主。然而上面所涉及的工作中所得到的甜蛋白基因在大肠杆菌中表达都不高。这是由于在大肠杆菌中，密码子的使用并不是随机的，而是具有很强的偏爱性。我们知道，大多数氨基酸由一个以上的密码子所编码，即存在密码子的简并性，故这些密码子的使用并不是随机的。进一步的分析表明，密码子的使用频率与细胞内tRNA含量(即tRNA的丰富度)呈正相关，特别是对于那些表达量高的蛋白质，基因中偏向于采用细胞内对应的tRNA含量较多的密码子。例如编码亮氨酸的密码子有6个，即UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG，然而，大肠杆菌中表达量很高的核糖体蛋白质的编码基因中88.8％的亮氨酸由CUG编码，相反CUA的使用频率则为0％。UUA、UUG、CUU、CUC四个密码子的总计使用频率仅有11.2％(孙乃思等，《分子遗传学》pp.251-253，1993)。以前所得到的应乐果甜蛋白基因都是按照植物基因的特点合成的，因而许多氨基酸所采用的密码子在大肠杆菌中对应的tRNA含量相对很低，导致该基因不能在大肠杆菌中高效表达。
本发明人首次完全采用细菌偏爱的密码子，并考虑到稳定性及甜度等诸多因素，完成了应乐果甜蛋白基因序列的设计及全序列人工合成。基因中GC含量为48.02％。并构建成重组表达载体，导入原核生物宿主中，该基因在原核生物中，尤其是在大肠杆菌中可以获得相对高的的表达。其中活性蛋白质产率约占细胞总蛋白的20％。因而本发明尤其适合利用发酵的方法来工业化大批量生产应乐果甜蛋白。
本发明提供了适于在原核细胞宿主中高效表达编码具有甜味活性的，对热稳定的应果甜蛋白的DNA编码序列。其特征是该序列是一条长度为294个碱基对的DNA片段，并且具有如附附图说明
图1所示的核苷酸序列或其功能等同物。该DNA序列是在不改变天然应乐果甜蛋白A、B两个肽链的氨基酸序列及其甜味活性的前提下，选用原核生物体，特别是大肠杆菌适用的偏爱密码子，借助于计算机的辅助设计而最后合成的。
本发明的应乐果甜蛋白编码DNA序列的密码子使用情况如下页附表1所示
表1甜蛋白中编码氨基酸的密码子使用情况
注M为该密码子的数目；A为该氨基酸的总数本发明的人工合成的应乐果甜蛋白基因可以通过DNA重组技术，连接到适当的原核生物表达载体中，以构建本发明的重组表达载体。
可用于本发明的与所说的人工合成的应乐果甜蛋白基因重组连接的原核生物表达载体一般具有以下几个特征一是要具有在原核生物中表达能力较强的启动子，且具有良好的调节控制系统。目前通常应用的原核启动子包括λ噬菌体PL启动子，T7噬菌体启动子，大肠杆菌乳糖操纵子的LacZ启动子，色氨酸操纵子的Trp启动子，Trp-LacZ杂合的tac启动子以及PBR322质粒的β-内酰胺酶启动子等。二是要具有一个有较强复制能力的复制子，如PMB1复制子、ColE1复制子、P15A复制子等。它可以使该质粒在其宿主菌中保持较高的拷贝数，这也是外源基因能够得以高表达的一个条件。三是要具有选择标记，可以通过施加选择压力，保证宿主细胞中的重组载体不会丢失。
本发明进一步提供了在开放阅读框架中携带有本发明的人工合成的应乐果甜蛋白DNA编码序列的重组表达载体。该重组表达载体中除了携带有所说的应乐果甜蛋白的DNA编码序列外，还带有λ噬菌体PR，PL串联启动子，cIts857基因，rrnB核糖体转录终止信号，PMB1复制基因，氨苄青霉素抗性基因等为其高表达所需的各种调控元件。
可使用任何已知的转化方法将本发明的重组表达载体转化到原核生物宿主细胞中，以表达所需的应乐果甜蛋白。可供选择的宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，假单孢芽孢杆菌、乳酸菌等在细胞内不含有能降解应乐果甜蛋白的内源蛋白酶的原核宿主细胞。但优选的宿主是大肠杆菌细胞。
本发明进一步提供了带有上述重组表达载体的重组体细胞，在本发明的一个优选实施方案中，提供了携带上述重组表达载体的大肠杆菌菌株，特别是大肠杆菌BL21-pGESP9。该菌株已按照布达佩斯条约的规定，于日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No.＿＿。
本发明进一步提供了以DNA重组技术生产应乐果甜蛋白的方法，该方法包括以下步骤1.基于应乐果甜蛋白的氨基酸序列，合成由原核细胞偏爱密码子组成的应乐果甜蛋白的DNA编码序列；2.将步骤(1)中所述的DNA编码序列与适当的载体相连接，得到携带编码应乐果甜蛋白的DNA序列的重组表达载体；3.将步骤(2)中得到的重组表达载体转化到原核细胞宿主中，得到重组体细胞；4.在适于表达所需应乐果甜蛋白的条件下，培养步骤(3)中得到的重组体细胞；5.从培养基中回收所说的重组体细胞，并分离和纯化所需的应乐果甜蛋白；根据本发明的优选实施方案，上述方法步骤(1)中所说的DNA序列由附图1所示的核苷酸序列或其功能等同物组成。
根据本发明的优选实施方案，上述方法步骤(2)中所说的载体是质粒pBV220。
根据本发明的优选实施方案，上述方法步骤(3)中所说的重组体细胞是携带本发明重组载体的大肠杆菌细胞。
总之，本发明使用DNA重技术，根据已知的应乐果甜蛋白的氨基酸序列，选用原核生物，特别是大肠杆菌偏爱的密码子，人工合成了应乐果甜蛋白基因，并构建成重组表达载体，导入原核生物宿主中，获得了应乐果甜蛋白相对高的表达，为该甜蛋白的工业化生产提供了一个可行途径。
图1所示为人工设计并合成的能表达出单链应乐果甜蛋白的DNA序列。
图2所示为图一的DNA序列所能表达出的应乐果甜蛋白的氨基酸序列。
图3表示的是人工合成的应乐果甜蛋白基因的七个基因片段在基因中的位置。
图4是应乐果甜蛋白基因的PCR合成过程示意图。
图5是带有本发明人工合成的应乐果甜蛋白基因的测序载体pGSP9-的构建示意图。
图6是带有本发明人工合成的应乐果甜蛋白基因的表达型重组载体pGESP9的构建示意图。
本文所用的术语″密码子″指的是基因中确定它所合成蛋白质的每个氨基酸残基的三个核苷酸顺序，即所谓的三联体密码子。由于有四种碱基，故密码子共有64个，其中61个编码常规的20种氨基酸，3个密码子不编码任何氨基酸，称为终止密码子，或称无义密码子。
本文所用的术语″偏爱密码子″指的是对于不同种类的生物体，由于其细胞内转运同一种氨基酸的带有不同反密码子的tRNA丰度不同，而导致该生物对于其基因中编码同一氨基酸的不同密码子具有选择性。因而在特定生物体内，如果某一基因中的密码子对应的tRNA含量高，则该基因所编码的蛋白质易于被翻译，基因的表达水平较高。反之，基因的表达水平较低。所以说，不同的生物具有不同的偏爱密码子。
本文所用的术语″重组载体″指的是利用DNA切接技术，将外源DNA编码序列连接到适当的载体DNA上所获得的带有外源DNA编码序列的新的重组DNA分子。
本文所用的术语″重组体菌株″指的是用各种适当的方法将重组载体转移到适当的宿主菌中，所获得的能表达所说的外源DNA编码序列的重组菌株。
本文所用的术语″表达″指的是在生物体内的基因经过转录和翻译等过程合成其所对应的蛋白质。
为了合成本发明的能够在大肠杆菌中以高产率表达应乐果甜蛋白的DNA序列，我们根据天然应乐果甜蛋白的A，B两条肽链的氨基酸序列，考虑到了总的64个密码子中除TAA、TAG、TGA三个终止密码子以外的61个密码子的用法；总共20个氨基酸中，除了只有一个密码子编码的甲硫氨酸和色氨酸外，其他18种氨基酸的每一个密码子的用法。设计的应乐果甜蛋白编码序列包含有更适于在原核生物体，特别是大肠杆菌中表达的密码子。另外，为了更有利于应乐果甜蛋白活性的维持，我们设计了一段DNA接头序列，以将A、B两条肽链的编码序列连接起来。所说的基因序列如附图1所示。该基因所编码的应乐果甜蛋白氨基酸序列如附图2所示。
使用CYCLONETMDNA序列合成仪(Biosearch公司)，合成了编号分别为63、64、65、59、61、62的单链DNA片段以及作为引物的66号和67号寡核苷酸片段(详见实施例1)。合成的各片段在基因中的位置如附图3所示。
然后按下文实施例1和附图4所示的程序，先经过两组PCR反应，分别合成一个长度为170bp和178个bp的两个DNA片段。这两个片段有50个碱基对的重复区。然后以这两个DNA片段为模板，以合成的66、67号寡核苷酸片段作为引物，再次经PCR反应合成全长为294bp的应乐果甜蛋白基因。
按下文实施例3及附图5所示的程序，将末端补平后的基因片段通过连接酶，连接到用限制性内切酶HincII切开的质粒载体pUC19上，所获得的重组质粒命名为pGSP。并按下文实施例4的程序进行DNA的序列分析。序列分析的目的是进一步证实所得到的重组载体带有的人工合成的应乐果甜蛋白基因与设计完全一致。测序所用的引物有两种，正向引物和反向引物，可以分别从正反两个方向进行序列分析。通过对pGSP的序列分析，获得了带有与设计甜蛋白基因完全一致的重组质粒，即pGSP9。
可供选择使用的在原核生物体内表达的质粒载体有很多，这些质粒载体都带有完整的阅读框架，即含有一个启动子和一个终止子，或另外带有其它的表达调控元件。在启动子和终止子之间有一段多克隆位点。这些多克隆位点分别包含有若干单一酶切位点。选用适当的限制性内切酶将载体切成线性，并用DNA连接酶将应乐果甜蛋白基因连到所选的载体上，从而构建成一个在启动子和终止子之间含有应乐果甜蛋白基因的重组载体。此外，对载体DNA还有两个要求，一是要具有选择标记，如抗生素抗性基因。这样，当将载体连同外源基因转入到细菌中，并进行大量发酵培养时，可以在培养基中加入抗生素，施加选择压，使杂菌和未转入外源基因的空宿主菌的生长受抑制，从而保证发酵过程中菌体的选择扩增，以提高蛋白的收获率。二是载体上必须有复制子，它使带有甜蛋白基因的载体进入宿主菌后，能随着宿主菌的分裂而复制，从而不会丢失，并保持较高的拷贝数。
本发明使用带有λ噬菌体PL启动子，rrnB核糖体转录终止信号，PMB1复制基因，氨苄青霉素抗性基因的原核生物表达载体pBV220作为所合成甜蛋白基因的克隆载体。该载体还带有clts857基因。该基因的表达产物是一种阻遏蛋白，可抑制PL启动子的活性。在42℃诱导条件下，阻遏蛋白失活，使PL启动子的启动能力得以正常发挥。
按实施例5及附图6所示的程序构建了原核表达载体pGESP9。克隆是采用NcoI和PstI双酶切将pGSP9上的甜蛋白基因定向连接到pBV220上。其中所利用的NcoI位点位于所合成的应乐果甜蛋白基因的5′端。然而，根据对pGSP9序列分析的结果，由于方向的原因无法用这两个酶直接从pGSP9上切下应乐果甜蛋白基因，故需要一次亚克隆，即先将pGSP9上的甜蛋白基因切下，补平后重新连接，筛选方向与原来相反的重组载体，并将该载体定名为pGSP9-。用NcoI和PstI双酶切对该重组载体进行鉴定。
本发明的应乐果甜蛋白基因通过与适当的表达载体连接后，可在任何原核生物中获得较高效率的表达，这些原核生物体包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，假单孢芽孢杆菌和乳酸菌等。本发明所提供的重组表达载体pGESP9特别适合于在大肠杆菌中表达，所以本发明优先使用大肠杆菌，特别是大肠杆菌BL21菌株做为表达载体pGESP9的受体宿主细胞。用于本发明中的大肠杆菌BL21菌株为本领域技术人员所熟知的。
可以使用任何适当的方法，如氯化钙法、电穿孔法、PEG介导法等将发明所提到的重组载体转入宿主细胞中，得到重组体宿主细胞。本发明人用氯化钙法将重组表达载体pGESP9转入了大肠杆菌BL21菌株中，然后使用抗生素筛选，获得了重组体菌株。
应用本发明所获得的重组体细胞可以进行应乐果甜蛋白的工业化大批量生产。在有选择压力的液体培养基中培养重组体细胞至对数生长期，然后通过适当方法收集、裂解菌体，并提纯重组体细胞所表达的应乐果甜蛋白。本发明采用超声波处理法裂解菌体，然后经过硫酸铵沉淀、透析、CM Sephadex C-25柱层析、再透析、真空抽干或冻干等步骤，获得了结晶体应乐果甜蛋白。
发明所得到的甜蛋白作为甜味剂可以加在咖啡、牛奶、茶叶等饮料或流质食品中。此外，作为食品添加剂，还可以应用它来生产一些新式的饮食产品，如不含碳化合物的甜饮料、甜酸奶、各种糕点、甜点心、糖果、口香糖等。
下面的实施例将进一步举例详细说明本发明，但不能被认为是对本发明的限制。下面的许多实验方法和步骤都可以用其它的一些常规方法所代替，这样的代替和本领域技术人员所熟悉的改动和改变，应落入本发明权利要求范围内。
实施例1应乐果甜蛋白基因的PCR合成应用Biosearch公司的CYCLONE DNA序列合成仪，合成了编号分别为63、64、65、59、61、62的单链DNA片段以及作为引物的66号和67号寡核苷酸片段。合成的各片段的碱基序列如下635′-GATCCCATGGAATGGGAAATCATCGACATCGGTCCGTTCACTCAGAACCTGGGCAAATTCGCTGTTGACGAAGAAAACAAAATCGGTCAGTACGGTCGTCTGACCTTCAACAAAGTTATC-3′(120b)645′-CGTCCGTGCATGAAGAAAACTATCTACGAAAACGAACGTGAAATCAAAGGTTACGAATACCAGCTGTACGTTTACGCTTCCAACAAACTGTTCCGTGCTGACATCTCCGAAGACTACAAA-3′(120b)655′-ACTCGTGGTCGCAAACTGCTGCGTTTCAACGGTCCGGTTCCGCCGCCGTAATAGGTAC-3′(58b)595′-CTATTACGGCGGCGGAACCGGACCGTTGAAACGCAGCAGTTTGC
GACCACGAGTTTTGTAGTCTTCGGAGATGTCAGCACGGAACAGTTT-3′(90b)605 -GTCGGAAGCG-3′(10b)615′-TAAACGTACAGCTGGTATTCGTAACCTTTGATTTCACGTGCGTTTTCGTAGATAGTTTTCTTCATGCACGGACGGATAACTTTGTTGAAGGTCAGACGACCGTACTGACCGATTTTGTTT-3′(120b)625′-TCTTCGTCAACAGCGAATTTGCCCAGGTTCTGAGTGAACGGACCGATGTCGATGATTTCCCATTCCATGG-3′(70b)665′-GATCCCATGGAATGGG-3′(16b)675′ -CTATTACGGCGGCGGAACCGG-3′(21b)DNA片段合成后，用高压液相层析法纯化所需的片段。并利用DU 70紫外分光光度计测定DNA的浓度。
按下述程序，以PCR技术合成并扩增应乐果甜蛋白基因。首先在两个0.5ml的Eppendoff管中进行了两组PCR反应，分别合成该基因的两个片段。A组PCR反应体系包含DNA片段63及DNA片段61各1μl，10×PCR缓冲液2μl(500mM KCl，100mMTris-HCl pH8.3，15mM MgCl2，0.1％明胶)，dNTP 1μl(含四种脱氧核糖核苷酸，浓度各为2.5mM)，Taq DNA聚合酶(Promeg公司)0.5μl(含1.5个单位)，加重蒸水至总体积为20μl；B组PCR反应包括DNA片段59和DNA片段64各1μl，10×PCR缓冲液2μl，dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加重蒸水至总体积为20μl。所用DNA片断浓度均为20pmol/ul。采用GeneAmp PCR System 9600型PCR仪(PERKINELMER公司)，按如下反应程序进行PCR93℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共进行5个循环。然后合并二管，补加如下成分2μl 10×PCR缓冲液，3μl dNTP，引物66和引物67各4μl(10pmol/μl)，7μl重蒸水，0.5μl Taq酶，按如下反应程序再次进行PCR反应93℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共进行20个循环。之后取2μl PCR反应液，用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查大约300bp的PCR产物的有无。
实施例2克隆载体的制备按下述程序制备用于本发明的克隆载体首先在100ml LB培养基中(每升含10克NaCl，5克酵母提取物，10克胰蛋白胨，调pH至7.4)接种携带质粒pUC19的大肠杆菌DH5α菌株(本实验室保存)，置37℃振荡培养约12小时。培养后转入250ml离心管中，在4℃，5000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀。然后用STE溶液(含有0.1N NaCl，10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)洗涤一次，再次离心收集菌体沉淀。用碱变性法(J.sambrook etal.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)提取质粒DNA。向菌体沉淀中加入5ml溶液I(50mM蔗糖，25mM Tris，10mMEDTA，pH8.0)，用旋涡混合器振荡，以使菌体沉淀完全悬浮。然后向细胞悬液中加入10ml新配制的溶液II(含有0.2N NaOH，1％SDS)，盖好离心管盖后轻轻上下颠倒几次，立刻冰上放置10分钟。再向管内加入7.5ml预冷的溶液III(3MKAc，pH4.8)，轻轻上下混匀数次，并在冰上放置15分钟。然后4℃，10,000rpm离心15分钟，收集上清液。向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀并在室温下放置10分钟。在室温下以10,000rpm离心10分钟，用70％乙醇将所得到的沉淀洗2次，并再次离心，去除乙醇。真空抽干DNA沉淀，并溶解于1ml TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA)中。向所得溶液中加入RNA酶A(Promeg公司)至浓度为200μg/ml，并于37℃保温0.5小时。将所得的DNA溶液分装于几个Eppendoff管中，分别用苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提。每次加入抽提液后，摇匀1分钟，然后以12,000rpm离心10分钟，小心吸回上层水相。最后再加入1/10体积的3M NaAc(pH4.8)和2倍体积的无水乙醇，混匀后在冰上静置沉淀10分钟。在4℃，12,000rpm离心10分钟，除去上清，用70％乙醇洗DNA沉淀并真空抽干，然后重新溶解在200μl TE缓冲液中。取1μl样品在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，以粗略确定pUC19质粒DNA的浓度。
在1.5ml Eppendoff管中加入5μl(约10μg)按上述方法所提取的pUC19质粒DNA，4μl HincII酶10×酶切缓冲液，2μl限制性内切酶HincII.(5U/μl)(Promeg公司)，加入重蒸水至40μl总体积。将酶切反应混合物于37℃水浴中保温1.5小时。然后于65℃保温20分钟，以失活所用的限制性内切酶。之后取2μl样品用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结果证实已完全将超螺旋的pUC19切成了2.7Kb的线状DNA。所获得的线状pUC19DNA即可作为克隆连接所合成的应乐果甜蛋白基因的载体。
实施例3合成的应乐果甜蛋白基因的克隆按下述程序将实施例1中经PCR获得的编码应乐果甜蛋白的基因克隆到载体pUC19上。
取16μl实施例1中所说的PCR产物(约含有1.2μg应乐果甜蛋白编码DNA)，加入0.5μl(3U/μl)T4DNA聚合酶(Promega公司)，混匀后于37℃保温10分钟，使用T4DNA聚合酶将所说的PCR产物的末端修成平头。然后对添成平头的DNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，约40分钟后，用长波紫外灯(365nm)照射观察DNA条带的位置。切下含有约300bp的DNA片段的胶块。用冻融法回收该DNA片段，即先加200μl苯酚，液氮冷冻4分钟，取出溶化，混匀后再用液氮冷冻。如此反复四次。然后以12,000rpm离心10分钟，吸取上层水相并再次用氯仿抽提一次。向所回收的约200μl上清中加入20μl 3M NaAc(pH4.8)和400μl无水乙醇，-20℃沉淀过夜。12,000rpm离心10分钟，并用70％乙醇洗所得DNA沉淀，再以12,000rpm离心5分钟。除去乙醇，真空抽干并用20μl重蒸水溶解沉淀的DNA。取1μl所回收的DNA，用DO70紫外分光光度计(Beckman公司)测260nm光吸收。经计算，回收的DNA浓度为70ng/μl。然后将如此得到的应乐果甜蛋白编码DNA与载体DNA相连接。在0.5ml Eppendoff管中进行如下连接反应。反应混合物包含10μl H2O，2μl连接酶10×缓冲液，5μl按上述方法所回收的DNA(约350ng)，2μl用HincII酶切成线性的pUC19载体DNA(100ng)，以及1μl(3U/μl)连接酶(Promega公司)。连接反应在22℃水浴中进行6～8小时。用所得到的连接混合物(包括恢复成完整pUC19和连入了甜蛋白基因的重组载体)转化大肠杆菌。
按下述方法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。先用2ml LB培养基接种DH5α单菌落，并在37℃振荡培养过夜。然后将DH5α菌体细胞转入200ml LB培养基中37℃振荡培养2～3小时，至OD600约为0.6。取出培养瓶并置冰上30分钟。然后在无菌条件下将菌体悬浮液转移到离心管中，4℃，5,000rpm离心收集菌体细胞。然后加入40ml预冷的0.1MCaCl2，再次离心，去除上清液。加入8ml 0.1M CaCl2重新悬浮细胞沉淀，再加入1.2毫升甘油，混匀后按每管200μl分装于1.5ml Eppendoff管中，置于-70℃冰箱中保存备用。
转化时，取出三管感受态细胞，在冰上溶化后，一管加入10μl上述的连接产物；一管加入2μl连接时所用的经HincII切过的pUC19载体DNA(阴性对照)；一管加入1μl未切的pUC19载体DNA(阳性对照)。混匀后在冰上放置约30分钟。然后转至42℃水浴中热激90秒。再向各管中加入700μl液体LB培养基，在37℃振荡培养45分钟，然后分别将将菌体悬浮液铺敷在添加了100ug/ml氨苄青霉素的固体LBX-gal平板上(含800μgIPTG600μg X-gal)，在37℃温箱中保温约18小时。保温后，取出平板观察转化结果，发现阴性对照平板上几乎没有菌落，阳性对照平板上出现密集生长的菌落。经连接的DNA转化的平板上有许多蓝白相间的菌落。从平板上选取白色菌落，接种于液体LB培养基中于37℃振荡培养12～18小时，然后小量提取质粒DNA并用限制性内切酶HindIII和EcoRI进行双酶切鉴定。选择能切下约300bp HindIII-EcoRI片段的克隆，如此得到定名为pGSP的重组质粒。该质粒的构建过程如附图3所示。
实施例4所克隆的甜蛋白基因的序列测定将含有重组质粒pGSP的重组体细胞在添加有氨苄青霉素100ug/ml的LB固体平板上划线。置37℃培养12～18小时后，选取单菌落并接种在5ml添加有氨苄青霉素100ug/ml的液体LB培养基中，置37℃振荡培养12～18小时后，一部分做为菌种在4℃保存备用。取大约1.2ml菌体悬浮液在1.5ml Eppendoff管中小量提取质粒DNA(方法与实施例2中提取质粒pUC19的方法相同)。并用苯酚以及氯仿抽提纯化所得的质粒DNA。乙醇沉淀后，将DNA溶于20μl重蒸水中，作为测序的模板DNA。
按如下方法对模板DNA进行变性处理。取大约2μg待测序的质粒DNA加H2O至32μl，再加入8μl 2M NaOH，轻轻混匀，于室温下(25℃)放置10分钟后，再加入7μl 3M NaAc(pH4.8)，4μl H2O和120μl无水乙醇，混匀并在冰上放置10分钟。最后以12,000rpm离心10分钟，除去上清，用70％乙醇将沉淀物洗涤两次，真空抽干，并将残留物重新溶解于10μl重蒸水中。然后加入2μl测序引物，2μl退火缓冲液(200mM Tris·HClPH7.5，100mM MgCl2，250mM NaCl)，轻轻混匀，并瞬时离心，于65℃水浴中保温5分钟后，迅速转至37℃水浴中保温10分钟，最后在室温放置至少5分钟，再次瞬时离心，完成模板DNA与引物的退火。
然后按下述程序完成测序反应。在分别标记A、C、G、T的四个Eppendoff管中分别加入2.5μl四种双脱氧的终止反应液(80uM dGTP，80uM dCTP，80uM dATP，80uM dTTP，8uM dd(A)(C)(G)(T)TP，50mM NaCl)，放于37℃水浴中预热。吸取2μl酶稀释缓冲液，加到置于冰上的Eppendoff管中，向各管内加入0.5μl测序用DNA聚合酶(构自Promega公司)，混匀备用。立刻进行放射性同位素的标记反应，在上面得到的经过退火后的含有变性模板及引物的管中(体积为14μl)加入3μl标记混合液(180uM dGTP，dCTP，dATP，dTTP，50mM NaCl)，1μlα-32P标记的dATP(10μCi)，以及2μl稀释后的测序用T7DNA聚合酶，轻轻混匀后，室温放置5分钟。迅速向在37℃水浴中预热的标有A、C、G、T的四个管中分别加入4.5μl标记反应液，混匀、瞬时离心，于37℃放置5分钟。然后向各管中分别加入5μl终止液{95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝和0.05％二甲苯蓝}，离心混匀，并于37℃放置2分钟，以完成测序反应。
使用DNA测序装置(Bio-rad公司)制备测序用的聚丙烯酰胺凝胶，并以聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行测序测定。取50ml胶液(每500ml含甲叉双丙烯酰胺1.5g，丙烯酰胺28.5g，尿素240g，10×TBE缓冲液50ml)，加入180μl过硫酸铵和30μl TEMED(Sigma公司)，制备垂直板聚丙烯酰胺凝胶。在电泳装置的上下槽中加入1×TBE作为电泳缓冲液(0.09MTris-硼酸，100mMEDTA)，预电泳1小时，以使测序板温度达到50℃左右。将上面制备好的待测样品置于80～90℃水浴中变性2～3分钟后，将样品按C、A、T、G的顺序分别加入到凝胶相邻的上样孔中，每个上样孔中加2～3μl。电泳约2小时，溴酚蓝走到板底部后，二次上样，然后继续电泳，以便读出更多的序列。待二次上样的溴酚蓝再次走到板底部时，结束电泳。然后，用X-光片在-70℃冰箱中放射自显影12～24小时。测序结果表明9号样品中含有正确插入的应乐果甜蛋白编码序列，其核苷酸序列与原始设计的编码应乐果甜蛋白的核苷酸序列完全相同。将所得质粒定名为pGSP9。
实施例5应乐果甜蛋白基因表达载体的构建按下述方法构建可在原核生物中表达应乐果甜蛋白的表达载体。
用实施例2中提取质粒pUC19的方法，从携带有质粒pBV220(张智清等，病毒学报6(2)111-116，1990)的大肠杆菌DH5α菌体中提取质粒pBV220。在下述反应体系中进行NcoI和PstI的双酶切4μl(约3μg)质粒pBV220DNA，3μl多用酶切反应缓冲液(Multi Core buffer)(Promega公司)，限制性内切酶NcoI和PstI各6个单位，加入重蒸水至总体积30μl。37℃酶切反应约2个小时。然后按实施例3所述回收DNA的方法从凝胶中回收pBV220的大片段(约3.66Kb)，以去除酶切后反应液中存在的被NcoI和PstI切下的NcoI-PstI寡核苷酸片段。将回收的DNA4℃保存备用。
为能够使用NcoI和PstI切下pGSP9上克隆的甜蛋白基因，按下述程序进行pGSP9的亚克隆先用BamHI和PstI双酶切上述质粒pGSP9，酶切的反应体系包含5μl(约5μg)质粒pGSP9DNA，4μl多用酶切反应缓冲液，限制性内切酶BamHI、PstI各15个单位，加重蒸水至总体积40μl。37℃酶切2个小时，然后进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，并按实施例3中所述的冻融法回收长度约300bp的甜蛋白编码DNA。
利用绿豆芽核酸酶(Promega公司)将回收后的甜蛋白基因的末端切平。所采用的反应体系包含有10μl(约1μg DNA)从pGSP9中回收的约300bp的甜蛋白编码DNA，5μl绿豆芽核酸酶缓冲液，0.5μl(90U/μl)绿豆芽核酸酶，35.5μl重蒸水。将上述成份加在1.5ml Eppendoff管中混匀，于37℃保温10分钟。重新用苯酚和氯仿抽提修饰后获得的两末端为平端的甜蛋白编码DNA。
接下来将上面得到的甜蛋白编码DNA连接到实施例2中制备的用HincII(切口为平末端)切成线性的质粒载体PUC19上。在1.5ml Eppendoff管中的连接反应体系包含0.5μl(约100ng)用HincII切开的pUC19质粒DNA，2.5μl(约50ng)上面纯化后的平端甜蛋白编码DNA，1μl连接酶缓冲液，1μl(3U/μl)T4DNA连接酶(Promega公司)，5μl重蒸水。连接反应在22℃水浴中进行约4小时。连接后按实施例3中所述的转化方法，将连接后的DNA加入到200μl DH5α感受态细胞悬液中。将该混合物在冰上放置30分钟，42℃热激90秒，37℃振荡培养45分钟，然后铺敷在X-gal平板上，于37℃保温约15小时。选择白色菌落并提取质粒DNA，通过用NcoI和PstI双酶切选出以正确方向连接了所需DNA片段的克隆。将该重组质粒定名为pGSP9-。用于酶切鉴定的反应体系包含2μl(约1μg)待鉴定重组质粒DNA，2μl多用酶切反应缓冲液，NcoI和PstI各5个单位，加重蒸水至总体积20μl。37℃保温1小时后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检查约300bp NcoI-PstI DNA片断的有无。选出所需要的pGSP9-质粒。
然后用NcoI和PstI双酶切pGSP9-质粒DNA，并电泳回收切下的甜蛋白编码DNA。在1.5ml Eppendoff管中的酶切反应体系包含5μl(约4μg)质粒pGSP9-DNA，3μl多用酶切反应缓冲液，限制性内切酶NcoI和PstI各12个单位，加重蒸水至总反应体积40μl。酶切反应于37℃下进行约2小时。回收的DNA经纯化后即可直接用于下述的连接反应。在0.5ml eppendoff管中的连接体系包含以下成分2μl(约100ng)按本实施例中上述方法制备的用NcoI和PstI双酶切并电泳回收的质粒表达载体pBV220 DNA，2μl(约100ng)上面所得到的pGSP9-的300bpNcoI-PstI片段，2μl T4DNA连接酶反应缓冲液，0.5μl(约3U/μl))T4DNA连接酶(Promega公司)，加重蒸水至总体积20μl。16℃连接过夜。
按照实施例3所述的制备大肠杆菌DH5α感受态细胞的方法，制备大肠杆菌BL21的感受态细胞。取10μl上述连接的DNA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，铺敷在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的LB固体平板上，37℃培养约15小时。菌落长出后，挑取24个单菌落于5ml液体LB培养基中，提取质粒并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分析，选择质粒较大的克隆，进一步进行酶切鉴定。酶切鉴定的反应体系包含2μl待鉴定质粒DNA约1μg，2μl多用酶切反应缓冲液，限制性内切酶BamHI和PstI各5个单位(Promega公司)。37℃保温2个小时，再通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检查，选择能切下约300bp甜蛋白编码DNA片段的克隆，并将所获得的质粒定名为pGESP9。
实施例6大肠杆菌重组体细胞中应乐果甜蛋白基因表达的鉴定先少量提取菌体蛋白，检测是否有外源蛋白的表达。挑取上面获得的携带重组表达质粒pGESP9的单菌落，接种于装有5ml液体LB培养基(添加有氨苄青霉素100μg/ml)的试管中，同时分别接种同样量的未携带任何质粒的大肠杆菌BL21宿主细胞(使用不添加任何抗生素的培养基)和携带质粒pBV220的大肠杆菌BL21细胞作为对照。在37℃振荡(250rpm)培养过夜。然后按1％的接种量再各自分别继代2管(体积均为5ml)，一管于30℃振荡培养约9个小时，另一管在30℃振荡培养约3个小时后，转入42℃摇床中进行热激培养6小时。
按下述方法进行菌体蛋白的小量提取将按上述方法培养得到的分别携带质粒pGESP9、pBV220以及未携带任何质粒的，经过或未经过42℃诱导表达的六份大肠杆菌BL21细胞悬浮液分别转入1.5ml离心管中，4℃下5,000rpm离心5分钟，除去上清并收集细菌细胞。将细胞用STE(0.1M NaCl，10mMTirs，1mM EDTA pH8.0)洗一次，加入20μl重蒸水，再加入20μl蛋白变性缓冲液(50mM Tirs PH6.8，100mM DTT，2％ SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，在100℃水浴中煮沸5分钟。然后在4℃下12,000rpm离心5分钟，各取10μl上清液经过16％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，在携带pGESP9质粒并经过42℃诱导的样品中检测到一条约11KD带。从而证明了在42℃诱导表达的条件下处于PL启动子控制下的外源应乐果甜蛋白基因获得了表达。
实施例7应乐果甜蛋白的提取，纯化及活性鉴定在15ml添加有含有50μg/ml的氨苄青霉素的液体LB培养基中，接种携带质粒pGESP9的大肠杆菌BL21细胞，在30℃振荡(250rpm)培养过夜。然后全部转入1500ml添加有氨苄青霉素50μg/ml的液体LB培养基中。置于42℃，以250rpm继续振荡培养6小时后，将细菌悬浮液在4℃下5,000rpm离心8分钟，收集细菌细胞。用40ml磷酸缓冲液A(0.05M Na2HPo4和0.05MKH2Po4，pH7.2)重新悬浮后，转入小塑料杯中，在冰浴中用超声波破碎细胞，每次30秒，间隔约30秒后重复操作，直至菌体悬浮液清亮。15℃下以40,000rpm离心30分钟，收集上清，转入小三角瓶中(总体积共37ml)。加入28.38g硫酸铵(至饱和浓度)，4℃过夜沉淀。然后在4℃下以10,000rpm离心10分钟，收集蛋白沉淀并溶解于20ml磷酸缓冲液A中。将上述液体装入大透析袋中，4℃下对磷酸盐缓冲液A透析过夜，并用已经用磷酸缓冲液A平衡过的CMSephadex C-25柱进一步层析纯化。用磷酸盐缓冲液B(0.05M Na2HPO4，0.05M KH2PO4，0.1MNaClpH7.2)洗脱。用蛋白紫外检测仪(HD-93-1型，上海嘉定康华生化仪器制造厂)监测并收集含有应乐果甜蛋白的洗脱物。再次透析脱盐。真空冷冻干燥后得到所需的结晶体应乐果甜蛋白。
用重蒸水稀释蛋白质产物，用品尝法检测其甜度。结果表明，我们按上述方法所得到的应乐果甜蛋白的甜度约为同重量蔗糖甜度的3000倍以上。
1.适于在原核细胞宿主中高效表达的应乐果甜蛋白DNA编码序列及其功能等同物，其特征在于该序列具有如下所示的核苷酸序列GAT
2.根据权利要求1的DNA编码序列及其功能等同物，其基本上由原核生物体偏爱密码子所组成。
3.根据权利要求2的DNA编码序列及其功能等同物，其中所说的原核生物体选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、假单孢芽孢杆菌和乳酸菌。
4.根据权利要求3的DNA编码序列及其功能等同物，其中所说的原核生物体是大肠杆菌。
5.包含根据权利要求1至3中任一项的DNA编码序列的重组表达载体。
6.根据权利要求4的重组表达载体，该载体除包含编码应乐果甜蛋白的DNA序列外，还包含适于在原核生物体内表达应乐果甜蛋白所需的调控元件。
7.根据权利要求6的重组表达载体，其中所说的调控元件包括串联连接的热诱导性启动子。
8.由根据权利要求6或7的重组表达载体转化的重组体细胞。
9.根据权利要求8的重组体细胞，其为重组体原核细胞。
10.根据权利要求9的重组体细胞，其为重组体大肠杆菌。
11.根据权利要求10的重组体细胞，其具有保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏登记号为No.的重组体细胞的特征。
12.生产应乐果甜蛋白的方法，该方法包括以下步骤(1)基于应乐果甜蛋白的氨基酸序列合成由原核细胞偏爱密码子组成的应乐果甜蛋白DNA编码序列；(2)将步骤(1)中所述的DNA序列与适当的载体连接得到携带应乐果甜蛋白DNA编码序列的重组表达载体；(3)将步骤(2)中得到的重组表达载体转化到适当的原核细胞宿主中，得到重组体细胞；(4)在适于表达所需应乐果甜蛋白的条件下，培养步骤(3)中得到的重组体细胞；(5)分离并纯化所需的应乐果甜蛋白。
13.根据权利要求12的方法，其中所说的应乐果甜蛋白DNA编码序列基本上由原核生物体偏爱密码子组成。
14.根据权利要求12的方法，其中所说的重组体细胞是重组体大肠杆菌。
15.根据权利要求12的方法，其中所说的重组体细胞是大肠杆菌BL21-pGESP9。
本发明提供了新的人工合成的应乐果甜蛋白DNA编码序列，包含该DNA编码序列的重组表达载体，以及携带所说的重组表达载体的重组体细胞。所说的DNA编码序列基本上由原核生物体偏爱密码子组成，特别适于在原核生物体内表达所说的应乐果甜蛋白。本发明还提供了生产应乐果甜蛋白的方法，在适于表达该蛋白质的条件下培养所说的重组体细胞，可获得高的表达效率，所说的应乐果甜蛋白具有大于蔗糖甜度3000倍的甜度，特别适用作为不提供热量的甜味食品添加剂。
文档编号C12N15/70GK11788
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者郭三堆, 崔洪志, 徐琼芳 申请人:国家科委风险开发事业中心创业公司, 中国农业科学院生物技术研究中心}