维C有什么好处啊，一天最多吃几片呢_百度知道
维C有什么好处啊，一天最多吃几片呢
低或基本没有副作用，家里有人出现突发的病症，还有美白的作用等vc是强抗氧化的营养素、解毒，过量会中毒的，先服用一些可以有效的保护身体。vc应该作为一种常用的补充剂常备才好：一种是医药合成的vc。目前用vc替代抗生素对疾病进行治疗也是一种趋势。我们能买到的vc一般分为两种。还有一种是天然vc的补充食品、抗压，食物中毒等状况是，作用多的在这里很难说全，这个你吃5000毫克都没问题，为进一步治疗争取时间，保护），很难留存在体内，具有生物活性的。vc是水溶性的。一般来讲主要是，所以有需要的话要稳定的补充，这个吃的时候一定要看说明书或尊医嘱、消炎，比如高烧、抗氧化（清楚自由基：抗菌
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恶心呕吐。 （2）维生素C可促进去铁胺对铁的螯合。 为什么“白领”需要更多的维生素C呢。 （体内过程）维生素C口服后在胃肠道，牙龈出血；（2）与巴比妥或扑米酮等合用，增加血管弹性，使铁的排出加速，尤其是维生素C；（2）尿糖，可增强精神-运动的反应性和集中注意力的能力；（4）长期大量应用维生素C，一次100—300毫克，癌症，又能与体内的维生素E自由基起作用，伴有胶原合成缺陷，维生素C易受破坏，“白领”需要更多的维生素，继续发挥抗氧化剂的作用，半胱氨酸等浓度升高。 （3）大量应用本品在一日1克以上时，使其还原为维生素E、蛋类，蔬菜的品种与数量少，极少数以原形物或代谢物从胃排泄，对水溶性维生素。 （5）建议以下情况慎用，或患有胃肠疾病，糖尿病：（1）大剂量长期服用维生素C可干扰抗凝药的抗凝效果,一日三餐中的维生素，头痛。所以。 （用法与用量）口服，溶液通常由无色到浅黄色—黄色—棕色，溃疡病，尿内排出量增多，维生素C缺乏，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶症，减低毛细血管的脆性，可经透析清除：一日50—100毫克，葡萄糖试验假阳性，尤以腺体组织内的浓度为最高；保持血液中的抗坏血酸的浓度。 （2）推荐膳食一日摄入量，特别是失眠的人，加速红细胞的生长，增强机体的解毒功能及对传染病的抵抗力，可干扰双硫醒对乙醇的作用。从组织水平看，需补充适量维生素C，牙和骨的基质，刺激造血功能，可收起泌尿系尿酸盐。（5）尿液pH下降，胃痉挛等症。 （药物作用）维生素C在体内参与多种反应，尿频，皮肤红而亮，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。 （6）注意事项，而轻度疲劳则是维生素C缺乏的最早症状。 （不良反应与注意事项）（1）本品长期大量服用（一日2—3克），维生素C的主要作用是与细胞间质的合成有关；（3）尿中草酸盐。它是多种自由基的清除剂，创伤时，且受到新鲜程度，可促使维生素C代谢的草酸盐，偶见腹泻，尿中抗坏血酸的排出量明显增加，经常精神紧张，慢性传染疾病及紫瘢等的辅助治疗。片剂在放置过程中遇光，以及毛细血管内皮细胞间的接合物，“白领”工作紧张，尿酸盐性肾结石，草酸盐治积症，半胱氨酸盐或草盐结石。研究表明，精神压力大，甲状腺功能亢进。（4）血清胆红素浓度下降：4—6岁小孩45毫克，痛风、烹调方式；（3）与纤维素磷酸钠合用。因此，主要是空肠部位吸收。包括胶原，可促进维生素C的排泄，因而需求量也高，热也易变色而失去疗效，瘀血点融合形成瘀斑，牙齿形成障碍和毛细血管破损引起大量瘀血点。具有中和毒素，尤其在碱性溶液中遇光或热更易变质，尤其是维生素C的消耗比一般人高。而只通过晚餐来补充维生素C，交草酸盐尿症，也可用于各种急，结核病，尤其是维生素C摄入不足。 其次、存放的时间等客观因素的影响。且有抗组织胺作用及阻止致癌物质亚硝胺生成的作用，显然是不够的。 （适应症状）（1）用于防治坏血病：（1）大便潜血假阳性；（5）水杨酸类药物可增加维生素C的排泄。一般的早餐以粮食、豆类或乳制品为主，密封处保存，孕妇80毫克，少量贮存在血浆和细胞中，因为他们生活节奏快，一日3次，哺乳期时；（6）制剂色泽变黄后不可应用，以及感染，故可用于慢性铁中毒的治疗？首先，停药后可出现坏血病。 （2）长期大量（一日2克以上）服用本品。 维生素C（搞坏血酸）在人体内主要作为酶的激活剂与物质还原剂而发挥作用。蛋白结合率低，铁粒幼细胞性贫血或地中海贫血，乳母100毫克，可致下列诊断性试验出现误差，尿酸盐，当维生素C缺乏所引起的坏血病时，成人60毫克：半胱氨酸尿症，一日最多不超过1克。口服维生素新产品UPSA-C维生素泡腾片，镰形红细胞贫血等，血色症，能理想地助你额外补充维生素C。经肝脏代谢，妇女妊娠期，故本品应在遮光。 （3）当病人接受慢性血液透析时，促进抗体生成。 此外维生素C还可减少毛细血管的通透性。（1）一般治疗用药，如参与氧化还原过程。当血浆浓度大于14微克时，其水溶液在空气中很快变质维生素C Vitamin C （性状与稳定性）维生素C合成品是一种白色的结晶性粉末。 （4）应用本品期间，表现为创伤通难以愈合
补钙啊。看医嘱啊。
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＞＞＞请根据免疫基本原理回答下列问题。(1)能正确表示病毒或细菌侵入机..
请根据免疫基本原理回答下列问题。(1)能正确表示病毒或细菌侵入机体后，引起血液中抗体浓度变化的是_____。(①表示第一次感染，②表示第二次感染)
(2)上题结果是因为在第一次感染病毒或细菌之后机体内产生了______细胞，该细胞可以在抗原消失后很长时间内保持对这种抗原的记忆，使第二次反应_______。(3)根据病毒入侵机体后引起血液中抗体浓度变化的规律，为提高人体对病毒的免疫能力，应采取的措施是向人体注射______。A．灭活抗原 B．抗体 C．抗生素 D．抗病毒药物(4)B淋巴细胞和T淋巴细胞依靠细胞膜表面的___识别抗原。(5)机体合成的数百万种抗体对抗原的特异性识别，是由于抗体分子结构中的___不同，究其根本原因是DNA分子转录形成了不同的___。(6)根据免疫过程是否有专一性、针对性，将人体的免疫分为________和________。
题型：读图填空题难度：偏难来源：期末题
(1)C(2)记忆&& 更快、更强(3)A(4)受体(抗原识别受体)(5)氨基酸序列&& mRNA(6)非特异性免疫&& 特异性免疫
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据魔方格专家权威分析，试题“请根据免疫基本原理回答下列问题。(1)能正确表示病毒或细菌侵入机..”主要考查你对&&免疫调节的类型，遗传信息的转录，免疫系统的组成和功能&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
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因为篇幅有限，只列出部分考点，详细请访问。
免疫调节的类型遗传信息的转录免疫系统的组成和功能
免疫调节的类型:免疫调节的类型：包括非特异性免疫和特异性免疫1、非特异性免疫：包括由皮肤、黏膜构成人体的人体免疫第一道防线和体液中的杀菌物质和吞噬细胞构成的第二道防线。人生来就有，不是针对某一类特定的病原体。2、特异性免疫（第三道防线） (1)组成：主要由免疫器官和免疫细胞借助血液循环和淋巴循环而组成。(2)作用：抵抗外来病原体和抑制肿瘤等。 (3)方式：体液免疫和细胞免疫。(4)过程 ①体液免疫： ②细胞免疫（4）主动免疫：利用抗原刺激，使机体产生抗体的方法，而非直接自体外引入抗体。主动免疫对随后的感染有高度抵抗的能力。可通过疾病病原体本身或通过免疫接种(使用已杀死的或弱化的疫苗或类毒素)产生。免疫须经几天，几个星期或更长时间才出现，但能长久甚至终生保持，且通过注射所需抗原很容易再活化。（5）被动免疫：机体通过获得外源性免疫效应分子（如抗体等）或免疫效应细胞而获得的相应免疫力。主动免疫和被动免疫的区别：主动免疫接种的是灭活或减毒的抗原，而被动免疫接种的事抗体。&知识点拨：体液免疫与细胞免疫的判断方法：1、据免疫的结果：如果免疫引起靶细胞裂解并释放其中隐藏的抗原，则为细胞免疫；如果两种成分结合形成沉淀或细胞集团，则为体液免疫。2、根据抗原的种类：如果抗原只进入体液，则为体液免疫；如果抗原进入组织细胞，则为细胞免疫。遗传信息的转录:1、概念：在细胞核内，以DNA一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程。&2、转录 (1)场所：细胞核（主要） (2)模板：DNA片段（基因）的一条链 (3)原料：四种游离的核糖核苷酸 (4)酶：RNA聚合酶等 (5)过程第一步：DNA双链解开，碱基暴露出来。第二步：游离的核糖核苷酸随机地与DNA链上的碱基碰撞，当核糖核苷酸与DNA的碱基互补时，两者以氢键结合。第三步：新结合的核糖核苷酸连接到正在合成的 mRNA上。第四步：合成的mRNA从DNA上释放，而后DNA 双链恢复。 (6)产物：RNA 转录和复制的比较：
主要在细胞和内
只解有遗传效应的片段
亲代DNA的两条链均为模板
DNA的一条链上的某片段为模板
解旋酶、DNA聚合酶等
解旋酶、RNA聚合酶等
四种脱氧核苷酸
四种核糖核苷酸
两个子代DNA
RNA与DNA的区别：
知识点拨：1、RNA的组成与分类 （1）基本单位：核糖核苷酸。（2）组成成分 （3）特点 ①一般是单链，长度比DNA短。 ②能通过核孔从细胞核转移到细胞质中。4．RNA的种类、作用及结构
5、DNA、RNA中核苷酸成分比较 ①一定相同的成分：磷酸。 ②一定不同的成分：五碳糖。 ③可能相同可能不同的成分：含氮碱基(A、U、T、 G、C)。 免疫系统的组成和功能：一、免疫系统的组成：二、免疫系统的功能：1、非特异性免疫（1）组成：①第一道防线：皮肤、黏膜。②第二道防线：体液中的杀菌物质（如溶菌酶）和吞噬细胞。(2)特点：人人生来就有，不针对某一特定病原体。 2、特异性免疫（第三道防线） (1)组成：主要由免疫器官和免疫细胞借助血液循环和淋巴循环而组成。(2)作用：抵抗外来病原体和抑制肿瘤等。 (3)方式：体液免疫和细胞免疫。(4)过程 ①体液免疫： ②细胞免疫3．监控和清除功能：监控并清除体内已经衰老或因其他因素而被破坏的细胞，以及癌变的细胞。 知识点拨：识别抗原和特异性识别抗原的细胞1、识别抗原的细胞：吞噬细胞.B细胞、T细胞、记忆细胞、效应T细胞。 2、特异性识别抗原的细胞：吞噬细胞只能识别自己与非己成分，因而没有特异性的识别能力，除吞噬细胞以外①中其余的细胞都有特异性的识别能力。 3、抗体与抗原结合后的反应 ①抑制病原体的繁殖，或揶制病原体对人体细胞的黏附。②多数情况下，抗原、抗体形成沉淀或细胞集团进而被吞噬细胞吞噬消化。4、体液免疫和细胞免疫的关系
知识拓展：1、免疫细胞的来源和功能
2、免疫活性物质并非都由免疫细胞产生，如唾液腺、泪腺细胞都可产生溶菌酶。 3、抗原和抗体 ①成分：抗原并非都是蛋白质，但抗体都是蛋白质。②来源：抗原并非都是外来物质（异物性），体内衰老、癌变的细胞也是抗原；抗体是人体受抗原刺激后产生的，但也可通过免疫治疗输入。③分布&&&&&&&&&&&&&& 抗原：主要存在于细胞外的抗原引起体液免疫，存在于细胞内的抗原由细胞免疫清除。抗体：主要分布于血清，也分布于组织液和外分泌液（如乳汁）中。
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【专题讨论】新手做WB的几张片子，请各位高人指点。
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这个帖子发布于2年零145天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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我是一个门外汉，刚刚做WB。做出来后全是模糊的片子，还有就是只有黑点，没有条带。一直没找到原因。恳请各位高人教导。并且按照以下的方法做。我做的是SD大鼠骨骼肌组织的蛋白检测，取300mg肌肉，最终加2.4ML裂解液。10000转离心10分钟。定蛋白也是按一下方法。上样按每10微升80微克蛋白上的样。用的是大连竞迈公司的垂直电泳仪。装模是半干法，按没分钟1KD转的。一抗1：1000.二抗1：6000。。 我测的蛋白在95KD左右，一半装2-2.5小时。但是结果不是背景强就是没东西。而且经常有黑点。方法4 免疫印迹 1样品制备和蛋白定量1.1 容液配制10ml100mmol/L PMSF:0.1742g溶于10ml的异丙醇中,至与4?C保存。 50ml 5mol/L NaCl:14.61g溶于40ml三蒸水中，定容至50ml。 100ml 20% SDS:20g溶于80ml水中，加热溶解，定容至100ml。 100ml 1mol/LTris-HCl: 12.114g溶于80ml三蒸水中，定容至100ml。配RIPA裂解液：
总体积（500ml）
5mol/L NaCl
TritonX-100
Deoxycholow
1mol/LTris-Hcl(Ph=7.4)
加三蒸水定容至500ml，使用前加PMSF至1%。1.2 蛋白提取（此步在冰上进行）组织称重，切碎，以每克组织加3ml RIPA裂解液，冰上以匀浆器匀浆，转到小离心管中，冰上放置40分钟，使其蛋白质充分裂解。4?C ，10000rpm，离心10min，取上清，转入小tube管中，-20 ℃贮存备用。1.3 蛋白定量Bradford 法定蛋白的原理：考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝G-250染液的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。采用Bradfold法进行蛋白定量，以1 mg/mlBSA 制作标准曲线。首先，配1mg/ml BSA(1mg BSA溶于1ml三蒸水)，按下表配置梯度浓度的标准溶液。
1mg/ml BSA
其次，将以上浓度的标准溶液依次加入96孔板中，每孔加40ul，制作平行孔。之后，将样品上清液用1×PBS稀释50倍（或100倍），混匀，以每孔40ul加入上述96孔板中，制作平行孔。根据不同浓度BSA在595 nm的不同的紫外光吸光值，用酶标仪测定样品在595 nm处的吸光值，用excel求出一元线性回归方程（y=kx+b），其中y是吸光值，x是测定的样品上清液的浓度，求出样品浓度（x值（ug/ul））。酶标仪设定参数：MODE:END POINT;WELL:96;FILTER(波长): 596振荡速度：MEDIUM;振荡时间：2min 2 SDS-PAGE2.1主要试剂配制30% 电泳凝胶：丙烯酰胺29.2 g，N, N-亚甲基双丙烯酰胺0.8 g，加三蒸水溶解，定容至100 ml，过滤后4℃备用。20% SDS： 20 gSDS，加三蒸水溶解，定容至100 ml。浓缩胶缓冲液：Tris-Base 30.25 g，20% SDS 10 ml，加三蒸水60 ml，饱和盐酸调pH 至6.8，定容至500 ml，4℃备用。分离胶缓冲液：Tris-Base 90.5 g，20% SDS 10 ml，加三蒸水约60 ml，饱和盐酸调pH至8.8，定容至500 ml，4℃备用。10×电泳缓冲液：29gTris-Base，144g Glycine，10 g SDS加500 ml三蒸水溶解，震荡混匀后，定容至1000 ml，4?C 备用，用时稀释至1倍。4×样品缓冲液：1.5MTris-HCl(pH 6.8)166 ul，20% SDS 400 ul，400 ul 甘油，0.062g二硫苏糖醇，0.005 g溴酚蓝，定容至1 ml，-20℃备用。1×磷酸盐缓冲液（PBS）：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，加800 ml三蒸水，振 荡混匀后，用饱和盐酸调pH至7.8，定容至1000 ml。10%过硫酸胺：0.2g溶于2ml三蒸水中，隔一周配一次，避光4℃放置。脱色液：500 ml甲醇，100 ml冰醋酸，加三蒸水至1000 ml。考马斯亮蓝染液（R-250）：2.5 g考马斯亮蓝R-250溶于500 ml 脱色液中。2.2 制胶用夹子夹好垂直电泳板，固定在电泳架上，先用蒸馏水检测一下是否漏水，将梳子放入玻璃板中，在距梳子的下缘1.5-2cm（浓缩胶的宽度）的地方画一条线；之后按下列配方配制分离胶，混匀，用20ml注射器注入电泳板缝，加之线的高度即可（分离胶的宽度）中，立即用酒精压平分离胶的上平面，使其成为一条线。约1小时待其凝固后，制备浓缩胶，移入玻璃板中，立即将梳子放入浓缩胶中，凝固0.5小时。表一12%分离胶的配方
分离胶(12%)
浓缩胶（4%）
30%电泳凝胶
10%过硫酸铵
2.3制样 每孔加样50-100 μg蛋白质，根据样品上清液浓度，计算每孔中蛋白质样品的体积，补1×PBS使体积为15μl，再向每个样品管中加5 μl 4×样品缓冲液，一切操作均在冰上进行。混匀后沸水浴3-5分钟，-20?C备用。2.4上样、电泳 将制好的胶放在电泳槽中，加满电泳缓冲液，轻轻拔掉梳子，用微量进样器加入处理好的蛋白质样品，左侧第一个孔道为蛋白Marker，依次在各个孔道中加入样品，并做好顺序记录。安装好系统后，4?C、220V电压下开始电泳，使蛋白质样品首先在浓缩胶中压缩成一条细带，然后继续电泳，直至样品指示剂-溴酚蓝到达玻璃板的下缘，关掉电源，取下制胶板，用刀片或镊子将两块玻璃板轻轻撬开，用单面刀片将浓缩胶切掉，将分离胶左上方切掉一个小角以标记样品顺序。（由于分离胶非常容易断裂，因此在移动前手需要保持湿润，也可在胶上滴加一些三蒸水。） 3 Western Blot原理：蛋白质样本和生物素标记的蛋白marker标准经SDS-PAGE后转于印迹膜上，然后经一抗→HRP 标记的二抗→HRP催化LumiGLO试剂发生反应并产生荧光→显影于X-光片上。其基本原理如下图：
3.1 主要试剂配制10×转移缓冲液(transfer buffer)：30.3 gTris-Base，144.1 g Glycine，500 ml三蒸水，振荡混匀后，定容至1000 ml，4℃备用。用时用0.1 M磷酸缓冲液即1×PBS和甲醇稀释至1倍，使甲醇的终浓度为20%（V/V），4?C备用。PBST缓冲液： 1×PBS加Tween20，使Tween20的浓度为0.1%。封闭剂（5%脱脂奶粉）：2g脱脂奶粉，40 ml PBST缓冲液，振荡混匀，4℃备用，可重复使用1次。转移平衡液：10ml 10×transfer buffer，20ml甲醇，70ml 三蒸水，振荡混匀。3.2 转移准备与胶同样大小的PVDF膜，和相同大小的8层滤纸。3.2.1平衡先将PVDF膜放在甲醇中平衡1分钟后（如果硝酸纤维素膜则不需要在甲醇中平衡1分钟），再放到1×的转移平衡液中平衡5分钟。将8层滤纸放在1×的转移平衡液中平衡5分钟。将电泳后的分离胶放到三蒸水中平衡1-5分钟（时间尽量短）。3.2.2转膜转膜仪的下面是阳极，依次放置已经在转移平衡液中平衡过的（顺序由下至上）4层滤纸、PVDF膜、电泳凝胶、4层滤纸（每放置一层需要用玻璃棒赶尽气泡，用滤纸将周围的液体吸干，注意千万不能将胶小于滤纸，否则将会导致短路）。在PVDF膜的左上角用铅笔标记样品顺序。在转移夹层的顶部放置阴极电极。接通电源，室温、220V转移25-30分钟。转移后的凝胶放到考马斯亮蓝R-250中染色，无明显条带显示表明转移效果较满意。3.3 封闭在25℃条件下，PVDF膜放入封闭液中（封闭好，以防液体挥发），以每分钟60转 恒温摇床上振荡60分钟。3.4 一抗结合依据抗体说明书的有效浓度，使用PBST和封闭液（1：1）来配置一抗，混合均匀。（例如膜为4×7.5cm2，配制4ml GAP-43(1:400)：2ml封闭液+2mlPBST+10ul抗体） 将PVDF膜放在一抗中。4?C孵育过夜（抗体的体积至少要覆盖膜表面，防止干燥。）。 一抗可回收再次使用（如连续使用放置4?C，否则放置-20?C）。洗去一抗：25℃条件下，摇床转速为75转/分钟，用PBST洗膜3次，每次在恒温摇床上振荡10分钟。3.5 二抗结合加入辣根过化物酶标记的山羊抗兔或抗鼠IgG (1:3000，制备时封闭液和PBST的比例为1:1)，37℃，60转/分钟，在恒温摇床上振荡60分钟。洗去二抗：25℃条件下，摇床转速为75转/分钟，用PBST洗膜3次，每次在恒温摇床上振荡10分钟。之后用PBS洗膜10分钟。3.6 ECL显色利用化学发光的原理，ECL Western印迹系统使得快速高灵敏度检测蛋白成为可能。在ECL Western印迹系统中，目的蛋白是通过辣根过氧化物酶偶联的抗体进行检测，检测反应的底物Lnminol在辣根过氧化物酶的作用下发生氧化化学发光反应，所发光在增强剂作用下，强度提高了1000倍，用感光胶片记录发光的位置和强度。?在平底容器（如香皂盒）中等体积加ECL试剂盒中1溶液和2溶液，混匀（注意避免光线直射）。PVDF膜放入平底容器中，将混匀好好的ECL溶液加到PVDF膜上，使液体和膜充分接触，轻摇5分钟。取出膜，吸干多余液体，然后将PVDF膜放在保鲜膜上包好（蛋白质面朝上），用玻璃棒赶尽所有的气泡和褶皱，放入暗盒中，剩下操作在暗室中进行。暗室对X射线胶片分别曝光30秒，1分钟，3分钟，5分钟，胶片放入显影夜3-5分钟，之后放入定影夜1-3分钟，自来水冲洗，晾干后观察，计算机定量扫描处理。
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楼上两位，我封闭一小时，用的是脱脂奶粉配的封闭液，抗体是多克隆的SANTA的抗体。转膜仪是固定电流的那种，上面显示输出电流是30毫安。封闭液都是用的新鲜的，没回收利用过。一抗一直是4度过夜。二抗是室温一个半小时、上面第三张片子的一抗是用的Proteintech公司的。不知道问什么会出现黑点，而且中间是白版。以前也总会出现这样的问题，不知道怎么回事啊。
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mdjdxslw2 两个问题：1、一抗用 western blot验证了吗？2、如果验证，并用了最适浓度，那就是没洗干净。应该重点考察这两项。一抗怎么验证啊？不好意思，新手刚做，还不知道怎么回事呢，关于最适浓度，试过1：500 ，的三种浓度，基本都是这样啊，只是1;500的背景很黑，就像上面一样啊，至于1：1000的虽然背景不怎么暗，但是黑点还是有的，就像上面做的那张空片自一样啊，中间白板，四周是黑点。
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philoblade 转膜恒压23V，40min试试我这转膜仪是固定电源的那种，没法调啊，上面只显示30MA电流，其他没显示啊！
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philoblade 看那张小黑点的胶，可以试试转完膜以后，膜再用甲醇活化10秒，然后再常规操作请问，您说的那个小黑点的是第几张片子啊？用甲醇活化是什么作用啊？在甲醇里泡10秒就行吗？
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谢谢各位的帮忙与指教。我刚刚做出了内参，是三塔的actin，说明书上说是分子量是43KD，但是做出来后有两条带子，一个在55左右，以个在25左右，而且25左右的那个带子比55的还要亮很多，请问这是怎么回事啊？是抗体的问题吗？
关于丁香园新手做Western Blot的几张片子，请各位高人指点
00:47:12&&&来源：&&&评论：&&
[新手做Western Blot的几张片子，请各位高人指点] 我是一个门外汉，刚刚做WB。做出来后全是模糊的片子，还有就是只有黑点，没有条带。一直没找到原因。恳请各位高人教导。并且按照以下的方法做。我做的是SD大鼠骨骼肌组织的蛋白检测，取300mg肌肉，最终加2.4ML裂解液。10000转离心10分钟。定蛋白也是按一下方法。上样按每10微升80微克蛋白上的样。 关键词:[一抗 蛋白质 抗体 封闭液 电泳 甲醇 转膜 分离胶]…
我是一个门外汉，刚刚做WB。做出来后全是模糊的片子，还有就是只有黑点，没有条带。一直没找到原因。恳请各位高人教导。并且按照以下的方法做。我做的是SD大鼠骨骼肌组织的蛋白检测，取300mg肌肉，最终加2.4ML裂解液。10000转离心10分钟。定蛋白也是按一下方法。上样按每10微升80微克蛋白上的样。用的是大连竞迈公司的垂直电泳仪。装模是半干法，按没分钟1KD转的。一抗1：1000.二抗1：6000。。 我测的蛋白在95KD左右，一半装2-2.5小时。但是结果不是背景强就是没东西。而且经常有黑点。
方法4 免疫印迹
1样品制备和蛋白定量
1.1 容液配制
10ml100mmol/L PMSF:0.1742g溶于10ml的异丙醇中,至与4?C保存。
50ml 5mol/L NaCl:14.61g溶于40ml三蒸水中，定容至50ml。
100ml 20% SDS:20g溶于80ml水中，加热溶解，定容至100ml。
100ml 1mol/LTris-HCl: 12.114g溶于80ml三蒸水中，定容至100ml。
配RIPA裂解液：
总体积（500ml）
5mol/L NaCl
TritonX-100
Deoxycholow
1mol/LTris-Hcl(Ph=7.4)
加三蒸水定容至500ml，使用前加PMSF至1%。
1.2 蛋白提取（此步在冰上进行）
组织称重，切碎，以每克组织加3ml RIPA裂解液，冰上以匀浆器匀浆，转到小离心管中，冰上放置40分钟，使其蛋白质充分裂解。4?C ，10000rpm，离心10min，取上清，转入小tube管中，-20 ℃贮存备用。
1.3 蛋白定量
Bradford 法定蛋白的原理：考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝G-250染液的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
采用Bradfold法进行蛋白定量，以1 mg/mlBSA 制作标准曲线。
首先，配1mg/ml BSA(1mg BSA溶于1ml三蒸水)，按下表配置梯度浓度的标准溶液。
1mg/ml BSA
其次，将以上浓度的标准溶液依次加入96孔板中，每孔加40ul，制作平行孔。之后，将样品上清液用1×PBS稀释50倍（或100倍），混匀，以每孔40ul加入上述96孔板中，制作平行孔。
根据不同浓度BSA在595 nm的不同的紫外光吸光值，用酶标仪测定样品在595 nm处的吸光值，用excel求出一元线性回归方程（y=kx+b），其中y是吸光值，x是测定的样品上清液的浓度，求出样品浓度（x值（ug/ul））。
酶标仪设定参数：
MODE:END POINT;
FILTER(波长): 596
振荡速度：MEDIUM;
振荡时间：2min
2 SDS-PAGE
2.1主要配制
30% 电泳凝胶：丙烯酰胺29.2 g，N, N-亚甲基双丙烯酰胺0.8 g，加三蒸水溶解，定容至100 ml，过滤后4℃备用。
20% SDS： 20 gSDS，加三蒸水溶解，定容至100 ml。
浓缩胶缓冲液：Tris-Base 30.25 g，20% SDS 10 ml，加三蒸水60 ml，饱和盐酸调pH 至6.8，定容至500 ml，4℃备用。
分离胶缓冲液：Tris-Base 90.5 g，20% SDS 10 ml，加三蒸水约60 ml，饱和盐酸调pH至8.8，定容至500 ml，4℃备用。
10×电泳缓冲液：29gTris-Base，144g Glycine，10 g SDS加500 ml三蒸水溶解，震荡混匀后，定容至1000 ml，4?C 备用，用时稀释至1倍。
4×样品缓冲液：1.5MTris-HCl(pH 6.8)166 ul，20% SDS 400 ul，400 ul 甘油，0.062g二硫苏糖醇，0.005 g溴酚蓝，定容至1 ml，-20℃备用。
1×磷酸盐缓冲液（PBS）：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，加800 ml三蒸水，振 荡混匀后，用饱和盐酸调pH至7.8，定容至1000 ml。
10%过硫酸胺：0.2g溶于2ml三蒸水中，隔一周配一次，避光4℃放置。
脱色液：500 ml甲醇，100 ml冰醋酸，加三蒸水至1000 ml。
考马斯亮蓝染液（R-250）：2.5 g考马斯亮蓝R-250溶于500 ml 脱色液中。
用夹子夹好垂直电泳板，固定在电泳架上，先用蒸馏水检测一下是否漏水，将梳子放入玻璃板中，在距梳子的下缘1.5-2cm（浓缩胶的宽度）的地方画一条线；之后按下列配方配制分离胶，混匀，用20ml注射器注入电泳板缝，加之线的高度即可（分离胶的宽度）中，立即用酒精压平分离胶的上平面，使其成为一条线。约1小时待其凝固后，制备浓缩胶，移入玻璃板中，立即将梳子放入浓缩胶中，凝固0.5小时。
表一12%分离胶的配方
分离胶(12%)
浓缩胶（4%）
30%电泳凝胶
10%过硫酸铵
每孔加样50-100 μg蛋白质，根据样品上清液浓度，计算每孔中蛋白质样品的体积，补1×PBS使体积为15μl，再向每个样品管中加5 μl 4×样品缓冲液，一切操作均在冰上进行。混匀后沸水浴3-5分钟，-20?C备用。
2.4上样、电泳
将制好的胶放在电泳槽中，加满电泳缓冲液，轻轻拔掉梳子，用微量进样器加入处理好的蛋白质样品，左侧第一个孔道为蛋白Marker，依次在各个孔道中加入样品，并做好顺序记录。安装好系统后，4?C、220V电压下开始电泳，使蛋白质样品首先在浓缩胶中压缩成一条细带，然后继续电泳，直至样品指示剂-溴酚蓝到达玻璃板的下缘，关掉电源，取下制胶板，用刀片或镊子将两块玻璃板轻轻撬开，用单面刀片将浓缩胶切掉，将分离胶左上方切掉一个小角以标记样品顺序。（由于分离胶非常容易断裂，因此在移动前手需要保持湿润，也可在胶上滴加一些三蒸水。）
3 Western Blot
原理：蛋白质样本和素标记的蛋白marker标准经SDS-PAGE后转于印迹膜上，然后经一抗→HRP 标记的二抗→HRP催化LumiGLO试剂发生反应并产生荧光→显影于X-光片上。其基本原理如下图：
3.1 主要试剂配制
10×转移缓冲液(transfer buffer)：30.3 g-Base，144.1 g Glycine，500 ml三蒸水，振荡混匀后，定容至1000 ml，4℃备用。用时用0.1 M磷酸缓冲液即1×PBS和甲醇稀释至1倍，使甲醇的终浓度为20%（V/V），4?C备用。
PBST缓冲液： 1×PBS加Tween20，使Tween20的浓度为0.1%。
封闭剂（5%脱脂奶粉）：2g脱脂奶粉，40 ml PBST缓冲液，振荡混匀，4℃备用，可重复使用1次。
转移平衡液：10ml 10×transfer buffer，20ml甲醇，70ml 三蒸水，振荡混匀。
准备与胶同样大小的PVDF膜，和相同大小的8层。
先将PVDF膜放在甲醇中平衡1分钟后（如果硝酸纤维素膜则不需要在甲醇中平衡1分钟），再放到1×的转移平衡液中平衡5分钟。将8层放在1×的转移平衡液中平衡5分钟。将电泳后的分离胶放到三蒸水中平衡1-5分钟（时间尽量短）。
转膜仪的下面是阳极，依次放置已经在转移平衡液中平衡过的（顺序由下至上）4层滤纸、、电泳凝胶、4层滤纸（每放置一层需要用玻璃棒赶尽气泡，用滤纸将周围的液体吸干，注意千万不能将胶小于滤纸，否则将会导致短路）。在的左上角用铅笔标记样品顺序。在转移夹层的顶部放置阴极电极。接通电源，室温、220V转移25-30分钟。转移后的凝胶放到考马斯亮蓝R-250中染色，无明显条带显示表明转移效果较满意。
在25℃条件下，PVDF膜放入封闭液中（封闭好，以防液体挥发），以每分钟60转 恒温摇床上振荡60分钟。
3.4 一抗结合
依据抗体说明书的有效浓度，使用PBST和封闭液（1：1）来配置一抗，混合均匀。（例如膜为4×7.5cm2，配制4ml GAP-43(1:400)：2ml封闭液+2mlPBST+10ul抗体）
将PVDF膜放在一抗中。4?C孵育过夜（抗体的体积至少要覆盖膜表面，防止干燥。）。 一抗可回收再次使用（如连续使用放置4?C，否则放置-20?C）。
洗去一抗：25℃条件下，摇床转速为75转/分钟，用PBST洗膜3次，每次在恒温摇床上振荡10分钟。
3.5 二抗结合
加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗鼠IgG (1:3000，制备时封闭液和PBST的比例为1:1)，37℃，60转/分钟，在恒温摇床上振荡60分钟。
洗去二抗：25℃条件下，摇床转速为75转/分钟，用PBST洗膜3次，每次在恒温摇床上振荡10分钟。之后用PBS洗膜10分钟。
3.6 ECL显色
利用化学发光的原理，ECL Western印迹系统使得快速高灵敏度检测蛋白成为可能。在ECL Western印迹系统中，目的蛋白是通过辣根过氧化物酶偶联的抗体进行检测，检测反应的底物Lnminol在辣根过氧化物酶的作用下发生氧化化学发光反应，所发光在增强剂作用下，强度提高了1000倍，用感光记录发光的位置和强度。
在平底容器（如香皂盒）中等体积加ECL试剂盒中1溶液和2溶液，混匀（注意避免光线直射）。PVDF膜放入平底容器中，将混匀好好的ECL溶液加到PVDF膜上，使液体和膜充分接触，轻摇5分钟。取出膜，吸干多余液体，然后将PVDF膜放在保鲜膜上包好（蛋白质面朝上），用玻璃棒赶尽所有的气泡和褶皱，放入暗盒中，剩下操作在暗室中进行。暗室对X射线分别曝光30秒，1分钟，3分钟，5分钟，胶片放入显影夜3-5分钟，之后放入定影夜1-3分钟，自来水冲洗，晾干后观察，计算机定量扫描处理。
转完的膜上有胶残留吗？如果没有的话，证明一抗不大好。
看了一下，你的背景深的图片上有条带的，但是也有杂带，可能是一抗不是很好，也有可能是封闭不够。
如果目的条带可能看出来，且周围杂带较少，结果也还可以用的。
同时，也建议你延长下封闭时间。封闭的牛奶就不用回收了，也不贵，牛奶放久了容易坏。转膜我一般用100v，90min。
一抗你可以试下4度过夜。
二抗就室温一小时。
我是这么做的，希望能帮到你。
一抗特异性不高，或封闭时间短，可适度延长！
楼上两位，我封闭一小时，用的是脱脂奶粉配的封闭液，是多克隆的SANTA的抗体。转膜仪是固定电流的那种，上面显示输出电流是30毫安。封闭液都是用的新鲜的，没回收利用过。一抗一直是4度过夜。二抗是室温一个半小时、
上面第三张片子的一抗是用的Proteintech公司的。不知道问什么会出现黑点，而且中间是白版。以前也总会出现这样的问题，不知道怎么回事啊。
多抗的话，一般效果和你上面两张差不多。后面的几张最有可能是抗体效果不好，建议联系试剂公司投诉，santa的可以换一只，黑点是抗体没纯化好的问题。
两个问题：
blot验证了吗？
2、如果验证，并用了最适浓度，那就是没洗干净。
应该重点考察这两项。
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一抗怎么验证啊？不好意思，新手刚做，还不知道怎么回事呢，
关于最适浓度，试过1：500 ，的三种浓度，基本都是这样啊，只是1;500的背景很黑，就像上面一样啊，至于1：1000的虽然背景不怎么暗，但是黑点还是有的，就像上面做的那张空片自一样啊，中间白板，四周是黑点。
转膜恒压23V，40min试试
楼上两位，我封闭一小时，用的是脱脂奶粉配的封闭液，抗体是多克隆的SANTA的抗体。转膜仪是固定电流的那种，上面显示输出电流是30毫安。封闭液都是用的新鲜的，没回收利用过。一抗一直是4度过夜。是室温一个半小时、
上面第三张片子的一抗是用的Proteintech公司的。不知道问什么会出现黑点，而且中间是白版。以前也总会出现这样的问题，不知道怎么回事啊。
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三鹰的抗体全蛋白做的多克隆抗体，容易出现这种情况。
转膜恒压23V，40min试试
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我这转膜仪是固定电源的那种，没法调啊，上面只显示30MA电流，其他没显示啊！
看那张小黑点的胶，可以试试转完膜以后，膜再用甲醇活化10秒，然后再常规操作
看那张小黑点的胶，可以试试转完膜以后，膜再用甲醇活化10秒，然后再常规操作
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请问，您说的那个小黑点的是第几张片子啊？用甲醇活化是什么作用啊？在甲醇里泡10秒就行吗？
对的，倒数第一二张
希望楼主考虑几个问题，背景黑，可能有两个原因：最主要是一抗的质量问题，其次是封闭时间以及封闭液选择的问题，ProteinTech的抗体还可以，背景不至于这样，楼主可以考虑延长封闭时间至2h或更长，同时一抗孵育结束后，用TBST洗膜10min*4，你图上的小黑点可能是封闭液的问题（考虑到你用的是脱脂奶,可能是牛奶没有充分溶解，附着在膜上，就会出现这种情况）,建议可以用8%BSA（因为背景高，可以用TBST来溶解BSA）作为封闭液试试，最后一点，楼主可以试试延长膜的平衡时间，建议在转缓中平衡2h以上才进行转膜，希望对楼主有帮助
谢谢各位的帮忙与指教。我刚刚做出了内参，是三塔的actin，说明书上说是分子量是43KD，但是做出来后有两条带子，一个在55左右，以个在25左右，而且25左右的那个带子比55的还要亮很多，请问这是怎么回事啊？是抗体的问题吗？
有黑点可能是因为你用的脱脂奶粉有不融的颗粒，孵育时粘附膜上面，在建议你吸取时不要把枪头伸进瓶子的底部
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