1. 内体ESCRT装置能分选泛素化修饰的膜蛋白 | 生命奥秘
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将膜蛋白有选择的转运到溶酶体（lysosome）进行降解是细胞维持正常代谢与生理功能所必须的。而泛素化修饰途径在该转运过程中也起到了辅助作用，它可以帮助细胞确定哪些蛋白应该通过多小泡内体（multivesicular endosome）途径被转运到溶酶体。内体蛋白分选转运装置（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）能将被泛素蛋白标记的“货物（cargo）”蛋白挑选出来，送入内体。然后借助与胞质分裂（cytokinesis）和病毒出芽（viral budding）过程一样的高度保守的过程帮助包裹有货物蛋白的小泡与周边的胞膜分离。ESCRT装置参与了机体抑制肿瘤、神经变性性疾病以及感染性疾病的过程，这说明它在细胞内具有非常重要的作用。
我们最早知道的有关泛素蛋白的功能就是泛素蛋白能够标记胞质中的蛋白质，使其被蛋白酶体降解，现在，我们又发现，泛素蛋白能够标记膜蛋白，使其被溶酶体降解。泛素介导的膜蛋白降解途径对于维持细胞正常的生理功能非常重要，该途径也能控制膜受体介导的信号通路。在质膜上存在的错误折叠的蛋白质、处于活化状态的生长因子、激素、细胞因子受体等等这些蛋白质都会经由细胞内吞作用（endocytosis）进入细胞内部，然后通过多泡的内体（multivesicular endosomes，MVE）被输送到溶酶体（图1），这些多泡的内体也经常被称为多泡小体（multivesicular bodies，MVB）。蛋白酶体降解途径是由泛素修饰途径介导的，如果靶蛋白第48位赖氨酸位点连接上了多泛素蛋白，那么它就会被蛋白酶体降解掉，但是如果该蛋白在第63位赖氨酸位点连接上了多泛素蛋白或者在多个赖氨酸位点连接上单泛素蛋白，那么它就会经溶酶体途径降解，此时，这些泛素修饰蛋白在内体膜上起到了分选信号的作用。进入内体的泛素修饰蛋白会被挑选出来进入管腔内小泡（intraluminal vesicles，ILV），因此不会再循环回到质膜上，也不能进入分泌途径，或者停留在内体膜上（图1）。
图1 细胞内吞作用（Endocytic internalization）与蛋白分选机制示意图。不同种类的膜蛋白都会通过细胞内吞作用进入细胞内，然后被转运至早期内体，这些早期内体也接收从高尔基体反面网状结构转运过来的蛋白。根据进入内体膜结构的蛋白不同，它们的转归途径也不同。营养素受体蛋白（nutrient receptors）等蛋白会被重新循环回到细胞膜上，这种循环途径分为两种，即1a所示的直接途径和1b所示的依赖循环内体结构的间接途径。而另一些蛋白，比如溶酶体酶受体蛋白和一些蛋白毒素会被分选运送到高尔基体反面网状结构，如步骤2所示。泛素化修饰的膜蛋白，比如活化的生长因子受体等则会被分选进入管腔内小泡，最后通过MVE进入溶酶体被降解，如步骤3所示。溶酶体膜蛋白也是先被分选进入MVE，然后再到达溶酶体的，如步骤4所示。自体吞噬体中的蛋白也是在溶酶体中被降解的。
我们现在对泛素依赖的内体蛋白分选（ubiquitin-dependent endosomal sorting）分子机制开始逐步有了一点了解。尤其是从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中分离到了空泡蛋白质分拣蛋白（vacuolar protein sorting，vps）突变体，我们借此发现了保守的泛素依赖的膜蛋白分选机制（ubiquitin-dependent sorting of membrane protein）是如何将蛋白从膜上转移到内体的ILV结构中的。当携带有膜蛋白的MVE与溶酶体，或者与酵母细胞中的空泡融合之后，ILV的膜就会被脂肪酶降解，而它所携带的膜蛋白则会被溶酶体蛋白酶（lysosomal protease）降解。内体对这些“货物”的分选开始于各种E3连接酶对“货物”的处理过程，这些泛素化过程通常都发生在质膜上，但是也会一直持续到内体膜上。有一些膜蛋白经泛素蛋白修饰之后就可以起到内化信号（internalization signal）的作用，还有一些其他的机制也可以促进细胞对蛋白的内吞过程。
在内体膜上，泛素化的“货物”会被ESCRT装置所捕获。这个过程由3个各不相同却又相互紧密配合的步骤组成，首先，内体会识别这些泛素化修饰的蛋白，阻止其进入循环途径重新回到胞质或质膜中；然后，内体膜变形、破裂，使其中的蛋白分选进入内体；最后，内体结构破裂，形成包含有各种蛋白的ILV结构。我们现在正在研究这三个步骤是如何完成的具体机制。目前的研究成果显示，内体中一个个的泛素结合亚单位（ubiquitin-binding subcomplexe）起到了货物分选的作用，也促进了能帮助内体膜破裂，内体小泡裂解的多体亚单位（multimeric subcomplex）的成核过程（nucleation）。在本文中我们将向读者介绍ESCRT是如何分选泛素化膜蛋白，使其进入溶酶体被降解的详细过程，还将介绍该途径的重要意义。
1. ESCRT的组成与形成情况
ESCRT装置由四个复合物和其它一些辅助组分构成（图2和表1）。这四个复合物分别是ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-III，我们是通过遗传学与生物化学的方法弄清楚这些复合物参与组成ESCRT装置的顺序以及各自的功能的。我们已经弄清楚了所有ESCRT复合物的结构，它们各自的详细结构生物学信息也已经被研究清楚了。
图2 ESCRT复合体的组成及其相互作用。图中给出了四个ESCRT复合体之间的相互作用，以及它们与泛素化修饰的“货物”蛋白、PtdIns(3)P、Alix、Vps4以及去泛素酶等其他辅助因子之间的相互作用。图中列出的是哺乳动物蛋白的名字，但是是根据酵母和哺乳动物的实验结果得出的结论。蛋白结构域以白色标出。虚线箭头表示根据遗传学研究预测的相互作用，但是还没有得到生化试验的验证。
表1 组成ESCRT复合体亚单位一览表
表1 组成ESCRT复合体亚单位一览表注：表中出于简化考虑主要使用了蛋白质的Vps名称，但是这些蛋白还有其他名称，大部分是哺乳动物蛋白。不过诸如Hrs、Tsg101、Alix这些哺乳动物蛋白因为其本身的名称已经被广泛使用，所以表中省略了它们的Vps名称。需要提醒读者注意的是，我们在这里认为辅助蛋白是与Vps4蛋白相结合，而不是与ESCRT-III复合体相结合，这是出于我们的理解，不过由于我们知识面的不足也不一定是正确的。
1.1 ESCRT-0复合物
ESCRT-0复合物由Hrs和STAM（在酵母细胞中是Vps27和Hse1）组成。最开始我们并没有把ESCRT-0复合物列入ESCRT家族，但是生化试验，细胞生物学试验以及遗传学试验都证实，ESCRT-0复合物能够招募ESCRT-I复合物，因此我们才将其列入ESCRT家族。ESCRT-0复合物的核心结构是由两个互相缠绕在一起的GAT结构域所组成的，而每一个GAT结构域又都由两个源自不同亚单位的螺旋结构组成。反向平行的卷曲螺旋结构（antiparallel coiled-coil）将这两个GAT结构域连接在一起。除了GAT结构域之外，在组成ESCRT-0复合物的两个亚单位之间还存在其他相似的结构。比如它们(Vps27、Hrs、STAM)在N末端都含有功能不明的VHS结构域，也都含有泛素蛋白结合结构域（ubiquitin- binding domains），笼形蛋白结合结构域（clathrin-binding domains）等。对于Hrs亚单位来说，最特殊的要数它能通过FYVE锌指结构域与内体脂质磷脂酰肌醇-3磷酸盐（lipid phosphatidylinositol 3-phosphate，PtdIns(3)P）相结合。实际上，是PtdIns(3)P与Hrs亚单位相结合才将ESCRT-0复合物招募到内体膜上的。
我们后来又在人体细胞中发现了第三个与ESCRT-0复合物有关的蛋白Eps15b，该蛋白也能与泛素蛋白相结合。虽然我们现在还不清楚Eps15b蛋白的具体功能，但我们可以肯定，Eps15b蛋白对于ESCRT-0复合物在对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptors，EGFR）进行分选时的功能非常重要。ESCRT-0复合物是所有ESCRT复合物中保守性最低的一个复合物，因此我们在植物中没能发现ESCRT-0复合物。可能会有一个或更多的“ESCRT-0蛋白”与Hrs和STAM一起起作用，或者就靠这些“ESCRT-0蛋白”就能起到Hrs和STAM蛋白的作用。TOM蛋白和GGA蛋白就具有这样的功能。与ESCRT-0复合物一样，这些蛋白也能与ESCRT-I复合物发生相互作用，这些蛋白也含有VHS结构域、泛素蛋白结合结构域和笼形蛋白结合结构域，它们也能与PtdIns(3)P结合蛋白相结合，从而进入内体膜结构（endosome membrane）。
1.2 ESCRT-I复合物
第一个被发现的ESCRT复合物就是ESCRT-I复合物，我们最开始在酵母细胞中发现了它，后来又在哺乳动物细胞中发现了。ESCRT-I复合物有四个亚单位按1:1:1:1的比例组成，这四个亚单位分别是Tsg101（酵母细胞中是Vps23）、Vps28、Vps37、Mvb12。我们已经通过晶体学研究的方法弄清楚了酵母细胞中ESCRT-I复合物的完整结构。ESCRT-I复合物具有一个“帽子（headpiece）”结构，通过该结构可以与ESCRT-II复合物相结合，还具有一13纳米长的刚性茎结构（stalk）以及末端结构，在末端结构中具有泛素蛋白结合结构域和与ESCRT-0复合物结合的结构域UEV。Tsg101蛋白和Vps23蛋白的UEV结构域能与ESCRT-0复合物的Hrs/Vps27蛋白中的PSAP样基序（PSAP-like motifs）相结合，然后在其他相互作用的帮助下，PSAP样基序能帮助ESCRT-I复合物募集到内体中。因此，如果没有ESCRT-0复合物的帮助，ESCRT-I复合物是无法募集到内体膜上的。
1.3 ESCRT-II复合物
ESCRT-II复合物由一个Vps36，一个Vps22和两个Vps25组成。ESCRT-II复合物的核心结构由八个翼螺旋结构（winged-helix）重复而成。Vps36的N末端含有一断裂的普列克底物蛋白同源结构域（split pleckstrin homology domain），我们发现该结构域能与内体膜上的3磷酸肌醇（3-phosphorylated phosphoinositides）结合。这个结构域在Eap45蛋白中还有一个名字，称为GRAM样泛素蛋白结合结构域（GRAM-like ubiquitin-binding in Eap45，GLUE），因此它也能与泛素蛋白相结合。ESCRT-II复合物能通过紧邻GLUE结构域C端的一螺旋结构与ESCRT-I复合物中Vps28蛋白C末端的结构域相结合。在酵母细胞Vps36蛋白中，GLUE结构域里含有两个插入的NZF锌指结构，其中一个锌指结构能与泛素蛋白相结合，另一个能与Vps28蛋白相结合。GLUE结构域除了能与脂质结合之外，Vps22蛋白中的第一个螺旋结构也能以特异性较低的方式与脂质相结合，这种结合作用可能也能帮助将ESCRT-II复合物募集到内体膜上。
1.4 ESCRT-III复合物
ESCRT-III复合物由一些携带电荷的小分子亚基以高度有序的方式在内体膜上组装而成。这些亚稳态（metastable）的亚单位通过自身C末端的自动抑制区（autoinhibitory）与N末端发生相互作用，起到了稳定亚单位自身的作用，维持它们处于失活的单体状态。在单体亚单位进行组装时构象改变会取消其自身的抑制作用，使它们能与其他亚单位进行结合。这种组装过程可能是以一种有序的序贯方式进行的，即一个亚单位激活另一个亚单位，如此一个个依次激活下去。根据我们对酵母细胞进行的生化研究结果来看，上述推测是正确的，酵母细胞ESCRT-III复合物就是由Vps20、Vps32、Vps24、Vps2按照上述高度有序的方式组装而成的。将ESCRT-III复合物组装到内体膜上的是Vps20蛋白，该蛋白的N末端发生了豆蔻酰化（myristoylated），我们认为正是该修饰作用使其能直接结合到内体膜上。Vps20蛋白还能与ESCRT-II复合物中的Vps25蛋白结合，而Vps25蛋白就是招募并活化Vps20蛋白的信号。因为ESCRT-II复合物含有两个Vps25蛋白，因此每一个ESCRT-II复合物就能招募两个ESCRT-III复合物到内体膜上，见图2。Vps20能直接与酵母细胞ESCRT-III复合物含量最丰富的亚基Vps32相结合，促使Vps32蛋白聚集形成被Vps24蛋白覆盖的丝状寡聚体。最后，Vps2与Vps24一起招募ATP酶Vps4。Vps4蛋白的募集过程与活性会受到两个ESCRT-III样复合物Ist1–Did2和Vta1–Vps60的调控，不过这两个复合物的具体功能目前还不清楚。
2. 捕获泛素化修饰的蛋白
ESCRT-0复合体、ESCRT-I复合体和ESCRT-II复合体都含有能与泛素蛋白结合的亚基，因此它们都能直接与泛素化修饰的蛋白结合。虽然生化试验结果表明上述这三个ESCRT复合体是共同以“超级复合体（supercomplex）”的形式发挥作用的，但是上位性试验（Epistasis experiment）表明，各个ESCRT复合体实际上是按照它们各自名字中数字的顺序来依次发挥作用。
ESCRT-0复合体可以被看做是将泛素化蛋白“截流”在内体膜上的“过滤器”（图3a）。ESCRT-0复合体中的泛素蛋白相互作用基序（ubiquitin-interacting motifs，UIM）与泛素蛋白间的亲和力比较低，那么它是如何能够有效的将泛素化蛋白吸附住的呢？ESCRT-0复合体可能会通过同时与靶蛋白上的好几个泛素蛋白结合来解决亲和力低的问题。EGFR这个在哺乳动物细胞中研究的非常充分的ESCRT复合体靶蛋白有力的支持了上述观点。在高浓度的EGF作用下，EGFR蛋白会被泛素蛋白修饰，既可以是在多个位点被单泛素蛋白修饰，也可以是在EGFR蛋白第63位赖氨酸位点被多泛素蛋白修饰。这种多泛素蛋白修饰的EGFR蛋白是ESCRT-0复合体的常见靶蛋白，也是最容易被降解的EGFR蛋白。值得注意的是Hrs蛋白的UIM基序能与两个泛素蛋白结合，如果该基序发生突变，丧失了这种“双面”结合能力，那么Hrs蛋白的分选功能也会受到影响。与Hrs蛋白不同，酵母Vps27蛋白含有两个“单面”UIM基序，这两个基序对于MVE的分选功能都非常重要，但是对于MVE的形成没有影响。
ESCRT-0复合体还有一条办法增强它与泛素蛋白间的亲和力，那就是增加局部ESCRT-0复合体的浓度。这可能是由Hrs蛋白借助它C端的笼形蛋白结合基序（clathrin-box motif）与笼形蛋白结合所致。通过这种方法能提高内体膜上笼形蛋白区域里ESCRT-0复合体的浓度，并增强ESCRT-0复合体的分选功能。我们认为，是ESCRT-0复合体最先在PtdIns(3)P的作用下被募集到内体膜上，然后经由笼形蛋白的聚合作用被聚集到一起（见图3a）。
与ESCRT-0复合体不同，ESCRT-I复合体和ESCRT-II复合体都只有一个泛素蛋白结合结构域，因此它们都不太适合担任蛋白分选工作，只能在泛素化蛋白都被ESCRT-0复合体分拣出来之后再发挥作用，见图3a。ESCRT-0复合体、ESCRT-I复合体以及ESCRT-II复合体的泛素蛋白结合结构域都能与泛素蛋白上第44位异亮氨酸位点的疏水区域相结合，这些“货物”蛋白可能就是通过这种方式从一个ESCRT复合体转运到另一个ESCRT复合体的。不过将ESCRT-1复合体中UEV结构域与“帽子”结构分开的刚性茎结构的存在，使得“货物”蛋白在同一个ESCRT-I复合体/ESCRT-II复合体组成的超级复合体中进行转运变得十分困难。但是“货物”蛋白可以从一个ESCRT-I复合体/ESCRT-II复合体的UEV结构域转运到另一个ESCRT-I复合体/ESCRT-II复合体的GLUE结构域。因为我们目前还不清楚ESCRT-0复合体的完整结构，所以还不清楚“货物”蛋白是不是能在同一ESCRT-0复合体/ESCRT-I复合体间转运。不过从ESCRT复合体的先后募集顺序来看，“货物”蛋白也应该是按照顺序依次转运的。不过这些ESCRT复合体中的泛素蛋白结合结构域与泛素蛋白间的亲和力都差不多，KD大约在0.1~0.3 mM之间，于是又产生了一个问题，“货物”蛋白怎么能在结合力相似的不同结构域间传递呢？“货物”蛋白可能会通过翻译后修饰的方式来调控与各个复合体间的结合。我们知道哺乳动物的ESCRT-0亚单位可以被磷酸化修饰，也可以被单泛素化修饰，如果被单泛素化修饰之后，这些蛋白就会处于失活状态。ESCRT-0复合体的Tsg101亚单位也可以被E3酶Mahogunin单泛素化修饰，这种修饰方式也能控制Tsg101蛋白的活化与失活状态。
图3 对内体膜上泛素化修饰“货物”蛋白起到分选作用的ESCRT装置示意图。a，“货物”蛋白进入笼形蛋白“笼罩”的局部区域。最开始是由ESCRT-0复合体识别出“货物”蛋白，而ESCRT-0复合体则是由图中粉红色的笼形蛋白募集到该局部区域的。然后ESCRT-0复合体再将ESCRT-I复合体募集到该处，ESCRT-I复合体再将ESCRT-II复合体招募过来，最后使得内体膜发生内陷。b，内体膜瓦解过程。ESCRT-III复合体与ESCRT-II复合体的两个Vps25亚基相结合被招募到该区域，然后形成一螺旋状丝状结构，将内体膜“顶”出一个凹陷，并将“货物”蛋白引导进入该凹陷处。在该过程中“货物”蛋白上的泛素化修饰蛋白会被由ESCRT-III复合体招募来的DUB酶去除掉，但是“货物”蛋白只能沿ESCRT-III复合体丝状结构运动，并不能随意扩散。c，膜破裂过程。随着ESCRT-III复合体不断形成螺旋状结构，内体膜也不断凹陷。同时Vps4蛋白也会进入该凹陷结构，解聚ESCRT-III复合体，这样ESCRT-III复合体在内体膜凹陷形成之后各个亚基就可以再重复利用。为简便起见图中没有给出黄色“货物”蛋白的胞质部分。
3. 内体膜结构破坏
电镜显示，在缺乏ESCRT的酵母细胞内体和小泡中没有ILV结构，但是却有一个奇怪的多片层内体（multilamellar endosome）。在哺乳动物细胞内进行的类似研究让我们发现了更多的信息，我们用siRNA技术分别干扰了不同ESCRT亚单位的表达，得到了各自不同的结果。不过无论结果如何，有一点是肯定的，那就是如果哺乳动物细胞缺乏ESCRT，就会减少ILV的形成。如果哺乳动物细胞内缺乏ESCRT-I复合体的亚单位Tsg101蛋白，那么也会与酵母细胞一样出现多片层内体。那么ESCRT复合体对ILV究竟起到了什么样的作用呢？
就我们过去所知道的细胞中受到胞质衣被蛋白调控的运输小泡的出芽形成过程，是很难理解小泡为什么能进入内体的，因为这与经典的出芽过程完全相反。酵母ESCRT-I复合体的长度达到了25纳米，这差不多就是酵母MVE中ILV的大小。据此我们推测ESCRT-I复合体除了参与蛋白分选工作之外可能还参与内体膜破裂过程（图3a和b）。不过到目前为止，只有一个实验证实了ESCRT-I复合体与ESCRT-III复合体一起参与了内体膜破裂过程。如果在哺乳动物细胞内过量表达ESCRT-III复合体的亚基Vps32，就会引起内体膜出芽并形成小管，该过程是由Vps32蛋白多聚体形成的螺旋丝（spiral filament）导致的。虽然内体膜不是ESCRT复合体组装的正常部位，不过形成的小管和小泡不论从大小方面还是从拓扑学方面都与ILV结构非常相似，这说明由Vps32介导的内体膜出芽过程就是ILV形成的机制。这一发现也符合Vps32蛋白是ESCRT-III复合体丝状结构的主要组成部分这一事实。
随后，我们又在体外使用重组蛋白进行了重建实验（reconstitution experiment），了解到了有关ESCRT-III复合体丝状结构组装过程更多更详细的信息。实验发现，缺乏C末端的Vps2A截短体蛋白能与Vps24蛋白一起组装，形成约50纳米长的中空的螺旋管道，管道外具有膜结合位点。Vps4蛋白能够结合在管道内部，并通过ATP水解酶作用使管道解离。Vps24蛋白和Vps24–Vps2蛋白都能形成管状结构，但是由Vps24–Vps2蛋白形成的管状结构可以被Vps4蛋白解离。使用单粒子电镜（Single-particle electron-microscopy）对Vps24蛋白形成的丝状结构进行观察发现，该结构是双链的管状结构，由相互平行且彼此紧挨的两个亚单位组成。Vps32蛋白也能在体外自我组装，但该组装过程太过混乱，以至于无法形成有序的结构。在体外形成的ESCRT-III复合体丝状结构不论从大小、拓扑结构还是对Vps4蛋白的敏感性等各个方面来看，都表明它们在ESCRT-III复合体的形成过程中具有重要作用，同时也说明这些丝状结构能够在内体膜上发挥某种功能。
对酵母细胞进行的体内研究表明，每一个组成ESCRT-III复合体的亚单位都能按照一定顺序发挥功能。而且还发现在体内，似乎只有Vps32蛋白同聚物参与形成了丝状结构。由于组成ESCRT-III复合体的不同亚单位之间在结构上都具有相似性，因此如果在膜结构和其他辅助因子都存在的条件下，提高其他亚蛋白的表达量，也能使它们形成多聚体，虽然在正常的体内环境中它们是不能聚集的。无论如何，体外组装实验都让我们第一次了解到了能够破坏内体膜结构的螺旋状的ESCRT-III复合体丝状结构是如何形成的。同时发现的Vps4蛋白能够在Vps2A–Vps24蛋白形成的小管内部发挥作用的现象也提示我们，Vps4蛋白能够进入正在形成的ILV，从内部破坏ESCRT-III复合体，这可能就是ESCRT-III复合体亚单位不能进入ILV的原因。
在哺乳动物细胞内，我们又发现了一个有关ILV形成的新成员，那就是PtdIns(3)P结合蛋白SNX3。在细胞内如果去除SNX3蛋白将会影响ILV的形成，但是不会影响到受体分选过程，这说明SNX3蛋白在内体膜破裂过程中起到了某种特殊的作用。但我们对其中的具体作用机制还不清楚，但是有实验发现，如果去除Hrs蛋白就会导致胞内SNX3蛋白水平降低，这说明Hrs蛋白可能和SNX3蛋白形成了复合体，但是目前还没有证据支持该观点。
4. 内体膜从内部被瓦解
在运输小泡出芽形成的过程当中细胞质膜会被破坏，这是我们大家都非常熟悉的现象了。我们认为是GTP酶介导的构象改变最终导致了质膜破坏。这种与传统出芽方式相反的，向MVE里面“出芽”的方式需要一种完全不同的装置，这样才能让充满胞质内容的膜突出，形成“小芽”（图3c）。与传统的膜瓦解过程不同，参与内体膜瓦解的装置是在内体内部的“小芽”中开始组装形成的。在细胞分裂、病毒出芽繁殖等过程中也出现过类似的膜突起结构，不断有证据表明ESCRT-III复合体和Vps4蛋白参与了这些过程（见图4）。系统进化分析法（Phylogenetic analyses）研究发现，ESCRT-III复合体是所有ESCRT复合体中最古老、最保守的一个。其他的ESCRT复合体可能是后来进化出来以便更好的分选“货物”蛋白的，也可能会参与膜瓦解过程。虽然在古细菌中没有内膜系统（endomembrane system），但是我们在古细菌（archaebacteria）中也发现了ESCRT-III复合体和Vps4蛋白的类似物。在这些物种中，ESCRT-III复合体和Vps4蛋白在细胞分裂质膜裂解过程中发挥作用。
图4 ESCRT装置参与的三种类似的胞膜破裂过程。ESCRT-III复合体是参与胞膜破裂过程的主要中坚力量。在MVE合成机制中，ESCRT-0、I和II复合体将ESCRT-III复合体募集到指定部位发挥作用。在细胞分裂过程中，ESCRT-III复合体被中心体或叫做中间体蛋白CEP55和Alix（有些时候也被ESCRT-I复合体）所招募。在HIV病毒出芽的过程中，ESCRT-III复合体由病毒的GAG蛋白和ESCRT-I复合体所招募，有时也会由Alix蛋白招募。
4.1 ESCRT复合体在胞质分裂过程中的作用
正如前面提到的，ESCRT复合体可以帮助细胞分裂，ESCRT-III复合体、Vps4蛋白以及Tsg101蛋白等似乎也都在哺乳动物细胞分裂末期胞膜裂解过程中发挥了作用。在细胞分裂过程中，上述这些蛋白通过Alix蛋白这个酵母细胞Bro1蛋白的同源蛋白和CEP55蛋白这个中心小体上的（centrosomal）卷曲螺旋同源二聚体（该二聚体在细胞分裂时会转移到中间体的环上）被募集到中间体（midbody）上，见图4。在高尔基体与内体来源的小泡融合之后，并且中间体的茎部被缩窄到不到100纳米时，Alix蛋白会促使ESCRT-III复合体将胞膜裂解。或者ESCRT-I复合体会通过Vps28 蛋白与Vps20蛋白间的相互作用直接募集 ESCRT-III复合体来发挥作用。
4.2 ESCRT复合体在病毒出芽过程中的作用
ESCRT复合体还有一个功能，我们发现Vps4蛋白和Alix蛋白也参与了细胞中病毒出芽的过程。各种病毒结构蛋白的“后期结构域（‘late’domain）”都含有3个替代序列（alternative sequences）：PPXY、P(S/T)AP和LYPXL，这三个序列分别能够与含有HECT结构域的泛素连接酶、Tsg101蛋白和Alix蛋白相结合。如果去掉了这些位点，病毒就无法破坏质膜被释放出去，只能不断聚集在质膜上。虽然我们还不清楚泛素蛋白在病毒出芽过程中的具体作用，但是我们知道泛素蛋白能通过与Tsg101蛋白相结合的方式来招募ESCRT-I复合体。然后ESCRT-I复合体可以直接或者通过Alix蛋白介导的方式招募ESCRT-III复合体，就像细胞分裂过程中描述的那样。在对由ESCRT复合体介导的三种质膜瓦解过程进行比较时我们很明显的发现，ESCRT-0复合体在ILV形成时招募了其他的ESCRT复合体，而CEP55蛋白和病毒的结构蛋白则在各自的生理进程中起到了相同的作用（图4）。
不过让人吃惊的是，虽然ESCRT-II复合体在酵母细胞MVE形成过程和蛋白分选过程中起到了关键性的作用，但是它却可以不参与细胞分裂过程、病毒出芽过程以及ESCRT介导的溶酶体降解被泛素化修饰的MHC-I类分子过程等等。可能ESCRT-I复合体的Vps28蛋白能直接与ESCRT-III复合体的Vps20蛋白直接结合，或者ESCRT-I复合体可以通过Alix蛋白与ESCRT-III复合体发生关联（图4）。因为Alix蛋白的Bro1结构域可以和ESCRT-III复合体的Vps32蛋白结合，而它C末端富含脯氨酸的结构域则可以和ESCRT-I中Tsg101蛋白的UEV结构域相结合。
4.3 质膜瓦解的机制
看起来好像ESCRT-0复合体、ESCRT-I复合体、ESCRT-II复合体、Alix蛋白都参与了细胞质膜的瓦解过程，但它们实际上就只发挥了一个功能，即招募ESCRT-III复合体。细胞分裂过程和病毒出芽过程具有很多相似之处。但是ESCRT-III复合体是如何致使胞膜瓦解的呢？这其中唯一已知的能量来自于Vps4蛋白水解ATP获得的能量，但是我们仍然不清楚该能量是如何导致细胞质膜裂解的。ESCRT-III复合体亚单位组装形成螺旋丝状结构对质膜破裂起到了重要作用。很容易想象出来，Vps4蛋白在内体膜内陷处将Vps32蛋白从ESCRT-III复合体丝状结构的一端一个一个的“剥离”下来，于是在此处形成了一道“缢痕”，这可能就足以将质膜断裂。或者，ESCRT-III复合体借助大量的管腔内结构域将“货物”蛋白聚集在一起，这可能也会起到破坏质膜的作用。
5. 去除“货物”蛋白的泛素化修饰作用
虽然泛素化修饰起到了信号分子的作用，帮助“货物”蛋白进入MVE，但是去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUB）在“货物”蛋白分选过程中的作用也同样重要。我们是通过对去泛素化酶Doa4的研究发现DUB酶的这一功能的。在酵母细胞中，Doa4蛋白被ESCRT-III 复合体和Bro1蛋白招募，以去除进入到内体里的“货物”蛋白上的泛素修饰作用，这一步骤对于MVE里的蛋白分选过程是必不可少的。对该过程最直接的理解是，它可以使泛素蛋白被再循环利用，从而避免细胞中的泛素蛋白被耗尽。不过这只是Doa4蛋白的作用之一。实验发现，Doa4蛋白还可以去除ESCRT亚单位上的泛素修饰蛋白，使这些亚单位蛋白解除自身抑制作用。在哺乳动物细胞里有两种在结构上毫无关联的内体DUB酶，它们分别是AMSH和UBPY。这两种DUB酶不仅能通过ESCRT-III 复合体和Alix蛋白被招募，也能由ESCRT-0复合体的亚单位STAM蛋白招募。这些DUB酶上富含脯氨酸的结构域能够与STAM蛋白中SH3结构域里的同一位点结合，在蛋白分选一开始的时候就被募集起来。这些DUB酶可能能去除掉那些本来不该进入MVE蛋白上的泛素修饰蛋白，也就是抵消了促进MVE分选功能的E3连接酶的作用。这些DUB酶可能还取消了单泛素化修饰对Hrs蛋白和STAM蛋白的自身抑制作用。不过UBPY能对第63位赖氨酸和第48位赖氨酸位点发挥去泛素化作用，但AMSH只能对第63位赖氨酸位点发挥去泛素化作用。于是我们又产生了一个想法，这些DUB酶是不是也负责改变“货物”蛋白的泛素化修饰状态呢？
6. ESCRT装置与自体吞噬作用
自体吞噬作用通俗的说就是细胞自己把自己给吃掉了，该过程实际上是细胞浆，包裹各种聚集的蛋白、入侵的微生物或者损伤的细胞器，然后被双层膜结构包裹形成吞噬泡最后形成自体吞噬小体（autophagosome）的过程。当自体吞噬小体与溶酶体融合之后，包裹在其中的内容物就会溶酶体酶所降解（图1）。细胞内正常水平的自体吞噬作用具有神经保护功能，但是一旦自体吞噬作用过强就会对细胞产生危害。对自体泛素化蛋白进行的自体吞噬作用也可以被看做是泛素蛋白介导的溶酶体蛋白降解途径，即第二条泛素介导的蛋白降解途径。虽然目前还不清楚自体吞噬作用是将聚集的蛋白降解掉了还是能够抑制蛋白聚集，但是我们知道，泛素结合蛋白p62既能够促使泛素化修饰的蛋白聚集，也能够促进它们被降解。因为p62蛋白能与Atg8蛋白发生相互作用，而Atg8蛋白就能够促发自体吞噬作用，所以p62蛋白可能能将小分子有毒物质聚集成大分子的泛素化修饰蛋白然后通过自体吞噬作用降解掉，即p62蛋白能通过自体吞噬作用有选择性的降解泛素化修饰蛋白。
最近我们发现ESCRT装置与自体吞噬作用之间具有让我们意想不到的联系。在ESCRT装置还未激活时细胞中自体吞噬体的数量会明显增多，这意味着ESCRT装置会直接或间接的调节自体吞噬作用。从原则上说，这种自体吞噬体数量上的增多可能是由于细胞在ESCRT装置不起作用时对各种应急刺激作出的反应，因而导致自体吞噬体形成增多。不过事实上自体吞噬体数量增多可能是由于自体吞噬体无法与溶酶体融合而造成的，因为在不表达ESCRT装置的细胞中自体吞噬体的数量也很少。于是问题出现了，ESCRT装置和自体吞噬体与溶酶体融合的过程之间到底有没有关联。实验证实，ESCRT-0和ESCRT-I复合体的某些亚单位能够与Vps18蛋白发生相互作用，而Vps18蛋白是HOPS装置的组分，HOPS装置就能够控制自体吞噬体和溶酶体间的融合，也能控制内体与溶酶体间的融合。但是到目前为止，我们还未能弄清楚上述过程的功能意义。而且如图1所示，自体吞噬小体形成的最后步骤就是从膜上脱离下来并封闭成一个小体，而这正是ESCRT装置的“拿手好戏”（图4）。也许在缺乏ESCRT的细胞中自体吞噬小体无法与溶酶体融合是因为它自身无法有效的合成，但是我们用现有的技术手段，如荧光标记或电镜等方法都无法观测到自体吞噬小体的组装完成过程。
7. ESCRT装置与人类疾病的关系
ESCRT装置除了能参与病毒出芽过程之外还能保护人体免受神经变性疾病、癌症和细菌感染等疾病的危害。如果人体ESCRT-III复合体亚基Vps2B出现了错意突变，人体就会出现神经变性性疾病，比如肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、额颞叶痴呆（frontotemporal dementia）等等。这些疾病都有一个共同的特征，那就是神经元细胞里泛素修饰蛋白进行性积聚，这可能就是由于自体吞噬作用不足所导致的。对于Vps2B蛋白突变导致神经细胞死亡还有另一种解释，那就是细胞下调神经营养因子受体（neurotrophin receptors）的功能受损，进而使内体持续释放信号，从而诱导细胞凋亡。
这种受体持续性的发放信号现象在肿瘤发生过程中也起到了关键性作用。Tsg101蛋白、Vps37A蛋白和Did2蛋白都是哺乳动物体内的抑癌因子。 如果敲除小鼠的Tsg101基因，那么就不会表现出抑癌活性，但是在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）体内，起到抑癌作用的是ESCRT-I复合体和ESCRT-II复合体，而不是ESCRT-0复合体。表达突变型ESCRT-I复合体或ESCRT-II复合体的细胞组织能形成肿瘤，这主要是由于突变细胞产生了过量的细胞因子，因此持续刺激细胞增殖所致。这是由于内体Notch信号通路反应过度所致，这同时也说明ESCRT装置对于抑制Notch信号通路的活性非常重要，因此，ESCRT装置在果蝇体内能起到抑癌的作用。不过它们是否能在哺乳动物体内起到同样的作用还有待考证。
吞噬细胞将微生物吞噬固定之后，形成的吞噬小泡会与溶酶体融合，随后被降解，这是机体天然免疫系统里非常重要的一条自我保护机制。不过有一些微生物，比如结核分支杆菌（mycobacteria）就能躲过机体的这条降解途径，并且能在吞噬细胞里面复制、繁殖下去。我们在用果蝇做实验材料筛选能抑制结核分支杆菌胞内生长能力的因子时发现ESCRT亚基具有这种作用，后来也在哺乳动物细胞中证实了ESCRT亚基的这种作用。现在还没有发现MVE对于吞噬溶酶体（phagolysosomal）的功能有什么重要的影响作用，因此ESCRT装置表现出的抗结核分支杆菌作用可能是通过其他途径发挥作用的。它可能参与了自体吞噬作用，因为有证据显示，自体吞噬作用也具有杀灭结核分支杆菌的功能。还有一种可能就是ESCRT装置能调控吞噬小泡与溶酶体的融合过程，这就好像它能调控自体吞噬体与溶酶体的融合过程一样。
8. 研究前景
ESCRT装置来源于低等单细胞生物的细胞分裂装置，后来才进化出能够识别内体中泛素化修饰蛋白的功能，也能在这些蛋白去泛素化修饰之后帮助它们进入ILV中。当然也有可能在高等生物种，某些ESCRT装置的亚基还具有别的其他功能。
结构生物学方面的研究进展让我们能够更好的了解ESCRT复合体的结果以及它们之间的相互作用情况（图2），但我们还是不清楚ESCRT-III复合体是如何在膜上组装，又是如何促使内体膜凹陷，形成ILV的。我们还需要弄清楚ESCRT-0、I、II复合体是如何与“货物”蛋白发生相互作用的，以及这些“货物”蛋白是如何从ESCRT-0复合体转运到IVL中的。“货物”蛋白即使是在单独的ESCRT-I复合体和ESCRT-II复合体之间进行转运也是不太可能的事情，我们还需要解释清楚这些“货物”蛋白是如何在复合体之间按照顺序进行转运并最终进入内体小泡中的。这种传递过程能够在体内完成，可能是通过磷酸化或泛素化修饰途径介导“货物”蛋白按照一定的顺序进行转运的。要想十分彻底的弄明白ESCRT的蛋白分选功能以及MVE的形成过程，我们必须要能够在体外用脂质膜重建MVE，还必须得纯化ESCRT的各个亚单位以及泛素化修饰的“货物”蛋白等等。不过随着我们对ESCRT装置以及它们辅助因子的了解越来越多，上述目标也离我们越来越近了。最近已经有人发表了有关他们在体外重建由ESCRT-III复合体介导ILV出芽释放过程的论文。他们发现，只需要Vps20蛋白、Vps32蛋白和Vps24蛋白就足以释放出ILV，而Vps2蛋白可以招募Vps4，让上述3个蛋白循环利用，进入下一轮的ILV形成过程。下一步工作就该是在体外重建由ESCRT装置介导的蛋白分选过程，这将会更加困难，但是在不久的将来，我们一定会实现这个目标的。
原文检索：
Camilla Raiborg & Harald Stenmark（2009）. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature, 458:445~452.
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