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胶回收方法全攻略
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今日：2 | 主题：287526
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【求助】让人抓狂的乙醇沉淀……
【求助】让人抓狂的乙醇沉淀……
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这个帖子发布于4年零111天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位前辈，
我的质粒100ul体系酶切后，用5ul跑胶电泳，条带结果可以，但是用乙醇沉淀后，却发现没条带了……快抓狂了！试剂换了，离心机也换了……结果还是这样，到底哪里出问题了，有哪位前辈给点建议呀，不胜感激！
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Cold EtOH Addition of NaAc pH 3.5 should help too.Are you sure about the final concentration? EtOH may not be very efficient for small pieces but for plasmid it really should work...Or try isopropanol.
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首先谢谢您！ 我乙醇沉淀就是用醋酸铵以及冰乙醇来沉淀的 而且其它沉淀还都可以 唯独PAC1酶切后会出现这样的问题 因为知道的东西很少 不知道这其中PACI酶会不会起到什么作用呢
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如果你觉得对于这个酶切产物沉淀总是不好，就做凝胶回收吧，不用在这上面耽误太多时间
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我之前的实验也遇到过同样的问题，可以简单的用酚仿抽提一次，再用乙醇沉淀就不会有这样的情况发生，可以试一下，当然乙醇需要预冷。或是用胶回收试剂盒不经过电泳，直接加等体积的溶胶液进行后续步骤纯化也可以，希望有帮助。
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谢谢以及Wyj1205两位前辈 我想我会按照你们的方法都试一下……
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首先确定乙醇沉淀完之后，有没有把沉淀不小心给弄没了，因为100ul体系的质粒DNA含量本身就不高，其次原因可能是DNA降解了，注意操作时用无核酶水，乙醇沉淀时保持低温，我常用-20°沉淀核酸
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切胶回收DNA失败，没经验，望指点
1.& & & & 吸附柱平衡：向吸附柱CB2中加入500 μL 平衡液BL，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
2.& & & & 捣碎胶，加入5倍PB结合液，混匀。60℃水浴10 min ，直到胶溶解为止，期间上下颠倒2~3次。
3.& & & & 冷却后，加入到已经平衡好的CB2中，室温2~5 min，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
4.& & & & 加入600 μL漂洗液PW (其中含80％乙醇),放置5 min，12，000 r/min 离心 1 min,弃废液，放回收集管
5.& & & & 重复上述4操作一次
6.& & & & 12，000 r/min 离心 2 min,CB2 开盖2~5 min，并甩空柱去除残留乙醇
7.& & & & 将CB2置于干净的收集管，加入洗脱液EB 30 μL，50℃ 水浴 2min，静置2~5 min
8.& & & & 12，000 r/min 离心 1 min,管底溶液为DNA 溶液
9.& & & & 去5 μL进行0.8 ％琼脂糖电泳检测
PCR 后检测有亮带，回收失败，不知还有什么需要注意的，望指点
就按protocol做就行了…你是量不够或者回收率低，换个kit用吧… 是不是PCR产物本来不是很多，你回收后电泳检测的时候上样量太少，看不到啊。
一般我都按照损失一半来算的。
不过，我很好奇你用的啥kit。啥试剂盒要用5倍PB:o
你前面用5倍PB，感觉胶浓度应该很大，那片段应该挺短；
可是你最后用0.8%的胶检测，又感觉片段应该挺大。
严格按照说明书做，如果回收条带很亮（正常曝光），不出来就换kit。 按照说明书一步一步来，没有问题，胶回收效率本身就不是很高，楼主可以多管样品一起回收 你5ul样品跑胶 加loading buffer了吗？
你用的KIT ，确定 是用60度溶胶？按着Protocol做 使用了多少样品进行回收？切胶是怎样操作的？
增加上样量，可以9ul PCR产物+1ul 10*loadingbuffer,多点几个孔然后一起切胶回收。其他的按照试剂盒protocol应该不会有问题 : Originally posted by 白菜吃虫 at
是不是PCR产物本来不是很多，你回收后电泳检测的时候上样量太少，看不到啊。
一般我都按照损失一半来算的。
不过，我很好奇你用的啥kit。啥试剂盒要用5倍PB:o
你前面用5倍PB，感觉胶浓度应该很大，那片段应该挺短 ... 恩，多谢！我用的是天根公司的普通DNA产物纯化试剂盒，说明书是用5倍的结合液，文献看到有用3倍的，不知道你怎么用，其实我回收的片段在500 bp左右，胶浓度确实比较小，如果换成1.5 ％,加3倍结合液，冷却后胶不会凝了吧 : Originally posted by desheng101 at
按照说明书一步一步来，没有问题，胶回收效率本身就不是很高，楼主可以多管样品一起回收 是将全部样品都用一支管回收？ : Originally posted by lyz65956 at
使用了多少样品进行回收？切胶是怎样操作的？
增加上样量，可以9ul PCR产物+1ul 10*loadingbuffer,多点几个孔然后一起切胶回收。其他的按照试剂盒protocol应该不会有问题 切胶样有0.5g,切胶是在紫外灯在切出大概的位置，在外面操作的，可能切到没有亮带之处，在短波长紫外灯照久了，DNA是诱变还是降解了呢？
上样我是将梳子用透明胶包起来，上样量就加大了很多，只是样品比较容易冲出到孔外。 1.第3步之后的滤液重新过柱，重复第3部，以提高片段的吸附率！
2.第6步之后，要等乙醇挥发完之后再进行下一步，方法是用鼻子闻不到味道为止。
3.第8步之后重复一次，提高洗脱率。
希望能帮到你！ : Originally posted by liyongliangx at
你5ul样品跑胶 加loading buffer了吗？
你用的KIT ，确定 是用60度溶胶？按着Protocol做 方案没有提到用多少度溶胶，我一开始用60度，发现不溶，升到了65度 : Originally posted by 小齐018 at
1.第3步之后的滤液重新过柱，重复第3部，以提高片段的吸附率！
2.第6步之后，要等乙醇挥发完之后再进行下一步，方法是用鼻子闻不到味道为止。
3.第8步之后重复一次，提高洗脱率。
希望能帮到你！ 多谢！:) : Originally posted by 美丽的家园 at
切胶样有0.5g,切胶是在紫外灯在切出大概的位置，在外面操作的，可能切到没有亮带之处，在短波长紫外灯照久了，DNA是诱变还是降解了呢？
上样我是将梳子用透明胶包起来，上样量就加大了很多，只是样品比较容易冲出 ... 当然DNA在紫外下时间越短越好，但是也没那么娇气。在紫外下切也没什么，但是要保护好眼睛更重要。切完后开紫外看看原来的位置还有没有条带。
500bp，如果没有其它条带干扰1%胶就行，3倍没问题，按说明书做。我们也用那盒子，挺好的。
量少的话多做几管，多离心几次，弄一个柱子里。
祝成功！ : Originally posted by 美丽的家园 at
方案没有提到用多少度溶胶，我一开始用60度，发现不溶，升到了65度... 一般溶胶是50-55度，65度是绝对禁止的，因为超过65度DNA会降解。。。
protocol明确写着的 : Originally posted by liyongliangx at
一般溶胶是50-55度，65度是绝对禁止的，因为超过65度DNA会降解。。。
protocol明确写着的... 鑳舵槸鐢ㄧ幓鐠冩鎹ｇ锛岃兌鍦60搴﹀緢涔呴兘涓嶆憾瑙ｏ紝鏅冨姩涔熶笉琛 最可能的原因是PCR产物较少，可以多P几管切！ : Originally posted by 美丽的家园 at
鑳舵槸鐢ㄧ幓鐠冩鎹ｇ锛岃兌鍦60搴﹀緢涔呴兘涓嶆憾瑙ｏ紝鏅冨姩涔熶笉琛
... ？？？ 你胶溶解温度太高吧 一般50度就可以了 十分钟&&期间每隔2分钟 上下颠倒混匀几次 绝对就溶解了 。还有 你竟然不在紫外线下切胶 ？敢问&&您是怎么看到条带的&&能保证把条带切完吗& & 当然DNA在紫外下时间越短越好，但是DNA也没那么娇气。在紫外下快点切没事的，但是要保护好眼睛更重要。切完后开紫外看看原来的位置还有没有条带。 : Originally posted by liyongliangx at
一般溶胶是50-55度，65度是绝对禁止的，因为超过65度DNA会降解。。。
protocol明确写着的... 我用55度溶胶,都快一个小时都不溶，胶已用玻璃棒捣的够碎，水浴期间每过2~3min就摇晃一下。我是要鉴定菌株，能否用PCR 扩增后体系代替切胶用试剂盒纯化呢？ : Originally posted by ljj0720 at
你胶溶解温度太高吧 一般50度就可以了 十分钟&&期间每隔2分钟 上下颠倒混匀几次 绝对就溶解了 。还有 你竟然不在紫外线下切胶 ？敢问&&您是怎么看到条带的&&能保证把条带切完吗& & 当然DNA在紫外下时间越短越好，但 ... 我用55度溶胶,都快一个小时都不溶，胶已用玻璃棒捣的尽量碎，水浴期间每过2~3min就上下颠倒混匀，不知你是怎样破碎胶的？异丙醇和乙醇在沉淀DNA时为什么所需体积不同?1.为什么异丙醇0.6倍.乙醇2倍?2.为什么异丙醇沉淀核酸时去多糖效果好?3.别粘贴复制那些转发烂了的帖子,也别一句分子极性大分子极性小就完事_百度作业帮
异丙醇和乙醇在沉淀DNA时为什么所需体积不同?1.为什么异丙醇0.6倍.乙醇2倍?2.为什么异丙醇沉淀核酸时去多糖效果好?3.别粘贴复制那些转发烂了的帖子,也别一句分子极性大分子极性小就完事
异丙醇和乙醇在沉淀DNA时为什么所需体积不同?1.为什么异丙醇0.6倍.乙醇2倍?2.为什么异丙醇沉淀核酸时去多糖效果好?3.别粘贴复制那些转发烂了的帖子,也别一句分子极性大分子极性小就完事了,
异丙醇比较疏水,能很更好地沉淀核酸,用乙醇的目的是去盐,它比异丙醇更亲水,所以能去掉一些盐离子.有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度.在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2倍体积乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效.异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用.但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐
也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。 2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1 0.25}