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外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测
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6 大肠杆菌基因工程(1)|基​因​工​程
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问题解决中
问题提出时间： 17:45:45
大肠杆菌表达异源蛋白IPTG诱导后37个小时到达最高峰？
我用全式金公司的pEASY E1 PRESS表达载体连接我要表达的甘露聚糖酶基因，转化到大肠杆菌表达菌种BL21(DE3)接到200mlLB培养基于34℃，200RMP摇培3个小时（OD到达0.6）加入IPTG1mM，分别于9，11，13，15，17…个小时测定酶活，该菌酶活是随时间一直递增，直到35个小时到达酶活顶峰，开始下降。
我看别人文献一般是10个小时以内就达到酶活顶峰，为什么我的要到35个小时，而且200mlLB培养基肯定营养耗尽，细胞自溶，是细胞自溶后释放了胞内积聚的酶（表达太快，来不及分泌出细胞外），还是在胁迫中它们更产酶?
PS:
pEASY-E1 Expression Vector简介
利用5分钟快速TA克隆技
术，克隆PCR产物于T7/lac启动子严谨调控、高效表达
的载体中。对照插入片段750 bp，表达的目的蛋白大
小约27 kDa。
● 快速克隆，仅需5分钟反应时间。
● PCR产物无需酶切，无需纯化，直接克隆。
● 高克隆效率。
● T7/lac 启动子严谨调控表达。
● N端 6×His蛋白纯化标签， 方便纯化重组蛋白。
我表达的蛋白是可溶性胞外酶，组成性酶，长度是400AA左右，
在诱导培养第9个小时候酶活是26.4U/ml,第27个小时时酶活是277U/ml,由于太晚了不想熬夜，就到第二天早上第33个小时测酶活就飙升到了1127U/ml，太恐怖了。
实在想不通，希望这里有老师能解帮助
行业分类：生物、医药
回答时间： 14:35:29
一个蛋白的表达受很多因素的影响，如菌落、温度、IPTG浓度与加入的时间，摇床的转速等。挑选的单菌落之间的表达其实也会有差异，可能原因就是拷贝数的多少和在细胞内的位置差异等。要加快并提高酶活性，需要对反应条件进行优化，如温度、IPTG浓度与加入的时间等。你可以先提总蛋白来观察细菌生长情况和目标蛋白的表达情况。
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回答时间： 15:12:13
一个蛋白的表达受很多因素的影响，如菌落、温度、IPTG浓度与加入的时间，摇床的转速等。挑选的单菌落之间的表达其实也会有差异，可能原因就是拷贝数的多少和在细胞内的位置差异等。要加快并提高酶活性，需要对反应条件进行优化，如温度、IPTG浓度与加入的时间等。你可以先提总蛋白来观察细菌生长情况和目标蛋白的表达情况。
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回答时间： 15:21:26
一个蛋白的表达受很多因素的影响，如菌落、温度、IPTG浓度与加入的时间，摇床的转速等。挑选的单菌落之间的表达其实也会有差异，可能原因就是拷贝数的多少和在细胞内的位置差异等。要加快并提高酶活性，需要对反应条件进行优化，如温度、IPTG浓度与加入的时间等。你可以先提总蛋白来观察细菌生长情况和目标蛋白的表达情况。
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回答时间： 18:51:10
一个蛋白的表达受很多因素的影响，如菌落、温度、IPTG浓度与加入的时间，摇床的转速等。挑选的单菌落之间的表达其实也会有差异，可能原因就是拷贝数的多少和在细胞内的位置差异等。要加快并提高酶活性，需要对反应条件进行优化，如温度、IPTG浓度与加入的时间等。你可以先提总蛋白来观察细菌生长情况和目标蛋白的表达情况。
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这个问题已提出一个月以上，回答功能关闭，如需求助可重新解释大肠杆菌乳糖操纵子的正调控和负调控
解释大肠杆菌乳糖操纵子的正调控和负调控
补充：可否分情况讨论，使答案更细致明确一些？
Escherichia&coli&(大肠埃希氏菌，简称大肠杆菌)乳糖操纵子包括依次排列的启动基因(P,&promoter)、操作基因(O,&operator&gene)、三个结构基因(structural&gene)。结构基因lac&Z编码分解乳糖的β-半乳糖苷酶(β-glactosidase),lac&Y编码吸收乳糖的β-半乳糖苷透性酶(β-glactoside&permease),lac&A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶(β-glactoside&acetylase)。操作基因lac&O不编码任何蛋白质，是另一位点上调节基因lac&I(inhibitor&gene)所编码的阻遏蛋白的结合部位。
①当培养基中沒有乳糖(或其他诱导物)存在时，由调节基因转录产生阻遏蛋白的mRNA，以该mRNa为模板合成阻遏蛋白，阻遏蛋白和操作基因结合，阻碍RNA聚合酶与启动基因结合，从而阻止其转录，不能合成相应的诱导酶。
②当在培养基中加入诱导物(乳糖或乳糖类似物IPTG)，诱导物可和阻遏蛋白结合并使阻遏蛋白变构，使它失活。失活的阻遏蛋白不能再和操作基因结合，此时结构基因能转录mRNA，并翻译成乳糖代谢所需的3种诱导酶。
③当E.coli在含有Glc和乳糖的培养基生长时，优先利用Glc，只有当Glc耗尽后，经过一段停滞期，才开始利用乳糖，因CAP(代谢产物基因活化蛋白,&catabolite&gene&activator&protein,&或写作CRP,&即cAMP受体蛋白cAMP&receptor&protein)与cAMP形成复合物结合在启动基因上，促进转录进行。
附注：“operator&gene”一语在国际上自20世纪70年代已很少使用，至80年代几乎绝迹，因operator只是一个阻遏蛋白结合位点，最多40bp，并无基因特征，亦无基因产物。
1&有葡萄糖 无乳糖——只利用葡萄糖
2&有葡萄糖 有乳糖——优先利用葡萄糖 因缺乏CRP-cAMP复合蛋白
3 无葡萄糖 有乳糖——利用乳糖
大肠杆菌的乳糖操纵子有些类似开车——若想启动汽车，仅仅松开刹车是不够的，还必须踩油门。
可以和色氨酸、阿拉伯糖、半乳糖等操纵子相互比较着来理解。
提问者 的感言：逻辑性不太好，看着不简明扼要，不过确能解决问题
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理工学科领域专家新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_（88）ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗的研究与应用--《南京农业大学》2004年博士论文
新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_（88）ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗的研究与应用
【摘要】：新生仔猪大肠杆菌性腹泻(Colibacillus diarrhea of newborn piglet)是由产肠毒素性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic E. coli, ETEC)引起的以1～7日龄新生仔猪下痢为特征的一种急性致死性多发性传染病。本病在世界范围内广泛流行，是影响仔猪成活率的主要因素之一。随着疫苗的研发与应用，我国新生仔猪大肠杆菌性腹泻得到了一定程度的控制，但疫苗在免疫原性、安全性等方面仍不理想。因此，研制高效、安全的新型多价基因工程疫苗迫在眉睫。
本研究利用分子生物学技术将ST_1基因与K_(88)ac和LT_B基因融合在一起，研制大肠杆菌三价基因工程灭活疫苗，以期达到增加疫苗的安全性，提高疫苗免疫效果的目的，解决新生仔猪大肠杆菌性腹泻免疫预防这一难题。
(1) 根据已发表的K_(88)ac、ST_1和LT_B基因序列，分别设计并合成一对K_(88)ac引物、三对ST_1引物和一对LT_B引物，利用PCR技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K_(88)ac基因、ST_1突变基因和LT_B基因。将质粒DNA和扩增的DNA片段进行分离、纯化、限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒pXK88acS73LT5并转化BL21(DE3)宿主菌，构建了含K_(88)ac-ST_1-LT_B融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实，构建的重组质粒pXK88acST3LT5中含有K_(88)ac-ST_1-LT_B融合基因，且基因序列和阅读框架均正确。将重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)按1％的量接种到含有Kan(50μg·mL~(-1))的LB液体培养基中，37℃振荡培养2h，然后用1mmol·L~(-1)IPTG诱导4h，融合蛋白K_(88)ac-ST_1-LT_B获得高效表达。经ELISA检测，重组菌株表达的K_(88)ac-ST_1-LT_B融合蛋白能够被ST_1单抗、LT_B和K_(88)ac抗体识别。将重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)培养物上清及菌体裂解物，分别进行了乳鼠灌胃试验，结果均为阴性(C／C≤0.083)，这表明该融合蛋白K_(88)ac-ST_1-LT_B已丧失天然ST_1肠毒素的活性。用该工程菌株制备的包涵体粗提物和工程菌灭活疫苗免疫小鼠，再用C83902大肠杆菌强毒菌株攻毒均获得了较好的保护，试
新生仔猪大肠杆菌性腹泻际ac一STI一LTI，二价基因「程灭活疫苗的研究与应用
里理里旦巴月里巴里里里里里里里里
验结果表明，肠ac一sT一LT。融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ST:
肠毒素毒性的作用，证实了构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基
因工程疫苗的候选菌株。
(2)对构建的表达K::aC一ST!一LT。融合蛋白的重组菌株BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)
进行了染色特性、培养特性、生化特性、质粒稳定性、免疫原性、保存条件等实验室
试验。结果1一10代菌种染色特性、培养特性、生化特性均符合大肠杆菌特性的要求;
在无选择压力(Kan一)T BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)菌株连续培养20代，统计质粒
丢失率，其重组质粒保留率为1 00%，表明重组质粒pXK88aeST3LTS在受体菌BL21(DE3)
中能较稳定传代:重组菌株BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)经诱导后的培养物，用SDS-
聚丙烯酞胺凝胶电泳和薄层凝胶扫描分析，结果表明融合蛋白占菌体总蛋白的相对含
量能稳定在73%以上;分另，J用BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)菌株第1代和第10代基础
种子的培养物制备的疫苗免疫小鼠后，用1 MLD(5/10吕CFU)强毒菌液攻击，其保护
率为90.6，表明1一10代基础种子均可作为疫苗生产用菌株，其免疫原性稳定。因此，
基础种子代次暂定为1一10代;菌种保存试验确定，甘油保存菌种在一20℃保存期为
2年，冻干保存菌种在一20℃保存期暂定为3年;最小免疫剂量测定结果表明小鼠的
最小免疫剂量每只为0.lmL，妊振母猪的最小免疫剂量每头为2.smL;制备的5批
实验室产品均安全有效;试验中本疫苗保存18个月，仍具有良好的效力，保护率达
8既以上，为了保证疫苗质量，并考虑疫苗在保存和应用中的各种不确定因素，将本
疫苗的保存期暂定为12个月。为了进一步验证疫苗的安全性和有效性，在不同地区
进行T田间试验，免疫妊娠母猪6 50头，产仔7 1 56头，平均保护率为98.2406，试验
证明本疚苗安全性良好，新生仔猪通过吮吸母乳获得被动免疫可有效地预防新生仔猪
大肠性腹泻的发生。
(3)以实验室工艺为基础，进行了工业化生产工艺的研究。用发酵罐培养，改
良LB培养基培养的菌数与普通肉汤培养基的菌数基本一致，明显高于LB培养基的菌
数，根据BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)菌株培养的稳定性和降低生产成本的要求，故改
良LB培养基为该菌株的最佳培养基;经诱导剂筛选试验分析，100 mmol·L一，乳糖组
诱导效果略低于1 mmol·L一，IpTG组，但优于10 mmol·L一，乳糖组，1 mmol·L一，乳糖
组诱导效果最差，在工业化生产上为了降低生产成本，故选择乳糖作为诱导剂;
aL21(nE3)(pxK88acsT3LTS)菌株添加终浓度为100 mm。l·L一，乳糖进行诱导后，目的
蛋白于Zh呈现表达，随着诱导时间的延长，总菌数和目的蛋白表达总数均相应增加，
5一6h趋于稳定，确定了乳糖诱导的浓度为10Omm。l·L一，，诱导时间不低于6h;通
气培养条件试验表明，BLzl(。Es)(pxKssacST3LTs)菌株以2、10，mL发酵罐通气培养，
在500L·min一
【关键词】：
【学位授予单位】：南京农业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2004【分类号】：S852.5【目录】：
中文摘要8-11
英文摘要11-15
符号及缩略语的说明15-16
第一章 文献综述18-62
1．新生仔猪大肠杆菌性腹泻的国际流行情况及我国流行现状18-33
2．新生仔猪大肠杆菌性腹泻病原(ETEC)致病因子研究进展33-53
3．产肠毒素性大肠杆菌基因工程疫苗研究现状53-62
第二章 新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗候选菌株的构建62-80
1．材料与方法63-70
2．结果70-78
4．结论78-79
参考文献79-80
第三章 新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗实验室生产工艺研究80-100
Ⅰ．基因工程菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)菌种的限定代次及保存条件试验81-88
1．材料与方法81-82
2．结果82-87
4．结论87-88
Ⅱ．安全性试验和最小免疫剂量的测定88-92
1．材料与方法88-89
2．结果89-91
3．讨论91-92
Ⅲ 实验室生产与检验92-96
1．材料与方法92-94
2．结果94-96
Ⅳ 保存期试验和田间试验96-99
1．材料与方法96-97
2．结果97-98
3．讨论98-99
参考文献99-100
第四章 新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗工业化生产工艺的研究100-116
1．材料与方法100-103
2．结果103-114
3．讨论114-115
4．结论115
参考文献115-116
第五章 新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗的现场应用及效益分析116-124
1．材料与方法116-118
2．结果118-122
3．讨论122-123
4．结论123
参考文献123-124
第六章 结论124-125
致谢125-126
本研究发表论文126-127
个人简介(中文)127-135
个人简介(英文)135-139
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