2010版中国药典培训回答（第3部分：无菌检查）
2010版中国药典培训回答（第3部分：无菌检查）
广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
1、 供试品传入无菌，对表面进行消毒。用75%无菌酒精浸泡表面是否可行？可用如何方法。（等紫外照射1h
酒精喷射，是否可行？注：无缓冲间的情况。从一般区直接进入传递窗）
答：用75%无菌酒精浸泡表面应该可行，但酒精易燃。 可用普通消毒剂如新洁尔灭等消毒。
2、无菌实验供试品在传入无菌传递窗前能否泡消毒液？
答：视包装而定。如：玻璃安瓿，可以；西林瓶，不可以。
3、检验针剂时，安瓿表面消毒可否用，如果可以，它会杀死样品本身的微生物吗？
答：我们没有碘液浸泡消毒的经验。 就浸泡方式而言，视包装而定，如：玻璃安瓿，可以；西林瓶，不可以。
4、微生物检查样品传递消毒处理，需作验证吗?如何确定其消毒效果？
答：验证当然最好，但也应结合常识、经验等，尽量减低工作量。
5、药典要求只要供试品的特性允许优先考虑薄膜过滤法。对于小剂量无抑菌作用的注射剂，是直接接种法好还是薄膜过滤法好？
答：优先考虑薄膜过滤法，可视样品包装情况而定。
6、无菌检查验证，2010年版方法改变，变换了大肠埃希杆菌，请问从前经过验证的无菌检查方法，实施2010年药典时是否必须从新的验证方法进行验证？验证后从能进行无菌检查？
答：应重新验证。
8、无菌制剂的处方与工艺都没有改变，10版药典出版是否还需重新验证？
答：10版用大肠埃希替代铜绿假单胞，应重新验证。
9、05版我们已经做了方法验证，10版还要再做方法验证吗？
答：如前所述。
10、做阳性对照，为什么同是做5批检样，到最后只是两到三批长菌？原因出在哪？滤膜吗？（我们是做抗菌素的产品）
答：原因是多方面的。请考虑方法的耐用性；此外，操作前后是否一致（比如：供试品溶液溶解是否彻底、供试品溶液的浓度是否一致、对滤膜滤筒的湿润、每次过滤对滤筒的荡洗、抽干、抽干是否过久等等）等等都有可能是影响因素。
11、清洁无菌室所用消毒液如何做到无菌拖把、拖桶如何做到无菌？
答：消毒液可采用过滤的方法。无菌拖把、拖桶可采用浸泡、高温灭菌的方法。
12、微生物的操作记录，可否直接用电子版进行记录。也就是将操作结果及过程记录在电子系统内？如细菌培养时间为72小时，在操作规程上可否写成为72±2小时。生产企业可否将有菌种的检查项目，如方法学验证、培养基适用性检查委托有资格的单位检验？
答：可直接用电子版进行记录。 细菌培养时间为72小时，建议在操作规程上写成为72小时。
生产企业应该可将有菌种的检查项目，如方法学验证、培养基适用性检查委托有资质的单位检验。
13、高压消毒炉的培训一般在哪里有举行？
答：广州：特种设备培训机构锅炉所
14、化妆品微控的容器洗涤一般用什么洗涤较好？
答：表面活性剂
15、贵所日常所用的消毒液是哪些？
答：新洁尔灭、消毒粉、75%酒精、来苏儿。
16、消毒液本来就是用来消毒杀菌的，又怎么会存在消毒液是否无菌这一说法？
答：消毒液不是万能的，对绝大对数菌有效，不排除对有些微生物无效。
有些消毒剂质量难保证，如果有效成分浓度过低甚至无，则达不到灭菌效果。
17、能否直接用电磁炉煮培养基（加热）？最佳加热方法是？
答：电磁炉不能加热玻璃瓶。我们所：水浴（100℃），微波炉。
18、硫乙醇酸盐流体培养基培养后会有点浑浊（排除是菌生长），是否可以在灭菌之前过滤培养基?
答：找出培养基混浊的原因，若是培养基与样品发生作用导致的混浊，灭菌之前过滤培养基也是没用的。硫乙醇酸盐流体培养基含琼脂，如果用滤膜，一般很难过滤；如果用纱布、棉花、滤纸等，则须考虑滤材对不同成分的吸附程度不同，可能造成培养基成分比例的改变。
19、方法验证时：对照加的菌液是最后才加吗？
答：按药典，在最后一次冲洗液中加入。
20、培养基适用性检查无菌性检查中“每批培养基随机取不少于5支（瓶））中”中“每批”指脱水商品培养基的生产批次，还是指制备的批次？
答：指制备批次的培养基。
21、微生物检验用的各种试剂除了化学纯，能否使用分析纯？
答：可以。
22、生物安全柜，净化操作台每年是否需要检定？
答：是的，我所是每年检定一次。并定期检测洁净度，频次自己制订。
23、无菌操作时，对显微镜硬件条件的需求是怎样？
答：显微镜：至少1000X，也就说要有油镜。
24、生产原料药的公司，其微生物检测方法采用限度检查法，请问洁净室的划分中还需要建立“无菌检查室”吗？
答：只要满足药典规定的万级背景下的局部百级即可。
25、阳性接种室，有没有硬性要求在万级区域局部百级区域？
答：无硬性要求。但应使用生物安全柜，并按生物安全柜的要求设置外围空间。
26、阳性操作间的空调系统是否应与微生物限度检查的空调系统完全分开，若未分开，是否可以采取直排的方式？（不利用阳性间的空调回风）
答：应分开。直排不等于分开。
27、微生物限度实验室和阳性对照室的洁净系统要分别独立，如用同一套的HVAC，但都是全排，是否能接受？
答：应分开。直排不等于分开。
28、微生物与无菌洁净系统也一定分别设置吗？
答：有条件最好将微生物限度检查与无菌检查洁净系统分开。
29、洁净区监控中，某些设备不宜采用冲淋法和接触碟法取样，而擦拭法中棉签释放率很低（普通棉签释放率只有20%左右）。请问如何设计采样方法才能真实反映设备表面微生物情况？
答：有些国外生产微生物检验仪器的大公司，有专用的小拭子，可能更有效。
30、用洁净服材质做成袋子来代替牛皮纸的包扎灭菌是否可行？
答：我们所目前采用此法。
31、环境监测用平皿预培养温度和时间?
答：30-35℃，时间不少于48h
32、灵敏度检测如何确定接种菌数量？
答：菌液在接种至灵敏度检测用培养基的同时用微生物限度检查法的平皿法测定每1ml菌液的cfu。
33、如何验证消毒剂消毒效果？
答：目前没有统一的方法，自行设计。
34、消毒剂消毒效果如何验证？如何设定SAL接受标准？
答：目前没有统一的方法，自行设计。
35、验证试验中，若供试品需加入β-内酰胺酶，那么阳性对照管是否应该加入等量β-内酰胺酶？
答：验证试验时，不加，因为对照管是用于比较试验菌生长情况的。
检验时的阳性对照则加。
36、全封闭式无菌验证中，用0.9%Nacl溶液溶解后，抽入集菌器中，样品溶液是否要停留几秒钟？让样品与滤膜充分接触或者停留后溶液造成抗生素残角？如何停留几秒钟？应在100ml试停留还是50ml时停留合适？
答：不应停留，应让样品尽快通过，避免抑菌成分被吸附。薄膜过滤法的目的是仅让微生物截留在滤膜上。
37、每张滤膜每次冲洗量一般100ml，总冲洗量不得超过1000ml，若供试品容量较大，总供试品样品量按标准规定超过1000ml，那这种情况应如何看待呢？
答：中国药典未规定供试品溶液的体积，设计检验方法时，兼顾供试品溶液的浓度和体积，尽量采用较小的体积。
38、装消毒剂的容器是否要求灭菌？例如用可灭菌的不锈钢材质，因为塑料的容器不能灭菌问题。
答：应该灭菌
39、配制用水最长可以放置多久？
答：视放置条件，经验证，自己设定。
40、对灭菌效果进行验证，多久进行一次？
答：根据自己工作情况，自己制订。
41、微生物限度检查时所用吸管是否均需计量？
答：无规定。
42、无菌，微生物限度实验，样品与阳性对照可以共用一个培养箱吗？答：有2种意见：其一，条件许可，分开，以免污染；其二，共用一个培养箱，使其在相同条件下培养。
我们：分开。
43、在无菌检查项下，供试品检验时，阳性对照是否必须每批都需做？是否供试品无菌试验跟阳性对照必须同步操作？
答：ChP要，同步。
做无菌检验，是否应另增加10瓶做阳性试验？（方法：薄膜过滤法，滤膜三分法，一份阳性，另两份置两种不同培养基中。
培养基灵敏度试验所用的菌种有6种，为什么没有大肠？
答：有专家解释：因铜绿与大肠均为革兰氏阴性杆菌，而铜绿在医院及自然界中更广泛存在，致病性更强。
如果产品经无菌验证后，是以大肠为对照菌时，可行吗？
答：如果验证6种菌均可行，建议按药典阳性对照章节的要求，设定阳性对照菌。如果验证结果样品是抗革兰阴性菌的，则阳性菌应用大肠埃希菌。
灵敏度试验可要加入大肠？
薄膜过滤法中，菌悬液的加入，在最后一次的冲洗液中加入小
于100cfu的试验菌，过滤，这个说法用封闭式过滤器（）要如何做？如果做法是加入培养基后，再从管子里加1ml的100cfu的菌，可行吗？
答：在最后一次冲洗液中，经封闭式过滤器顶部的透气孔加入1ml的少于100cfu的菌液，抽干，再加培养基。
48、"全封闭式无菌检验中，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，我们验证的是50ml*3
100ml*3，总冲洗量不超1000ml,可行吗？"
答：可行。
49、《中国药典》无菌检查方法验证中“菌种加在最后一次冲洗液中，过滤”，如果某供试品无菌检查方法无需进行冲洗，那么菌悬液应该加在哪合适？
答：药典无规定，可在过滤完样品后直接加菌液，然后加入培养基。
50、"无菌验证后，试验菌数经测定，若加入菌数大于100cfu,该情况如何处理？是否需要判断其试验无效，重新验证"
答：重新验证。
51、南方天气湿度大，易发霉，毛巾或者衣服上可能有黑色的霉点洗不干净，请问有没有好的方法去除霉点？
答：漂白、消毒。
52、粉针注射剂，同一个品种有不同规格的产品，在建立方法学验证时是否每个规格都需要进行验证？
答：理论上，以最大规格建立的方法应适用于其他较小规格。
但这样做可能会提高成本，因小规格的冲洗量、灭活剂等用量可能可以更少，难以一概而论。
53、无菌检查方法中阴性对照，每瓶溶剂，稀释液，冲洗液都需要收集，是不是每做一批试验，都需同时操作两台集菌仪？阴性对照能否每一批溶剂，稀释液，冲洗液抽一、两瓶做阴性对照？
答：不一定每做一批试验，都需同时操作两台集菌仪。
阴性对照不应该仅仅每一批溶剂，稀释液，冲洗液抽一、两瓶做阴性对照，应尽可能将所用到的每瓶都留少量做阴性。
54、"每一张膜总冲洗量不得超过1000ml,这个总冲洗量包括样品溶液吗？"
答：不包括。
55、无菌性检查，培养基是直接拿去培养，还是按照说明书灭菌处理后再拿去培养？
答：成品培养基直接培养；脱水培养基或自己配制的培养基灭菌后拿去培养。
56、液体硫乙醇酸盐培养基（中检所）极易被氧化，药检所做实验时是将管装量定在多高？
答：我们所用的是全封闭一次性滤筒，装量100ml，高度约6.5cm。57、如果培养过程氧化层高度已超过药典中要求的1/2高度，并发现其中长菌，结果如何判定？若未长菌，结果判定认为无菌是否成立？此类问题应该如何衡量？
答：如果培养过程氧化层高度已超过药典中要求的1/2高度，并发现其中长菌，可判断为不合格；
若未长菌，按药典，结果判定认为无菌应不成立；
此类问题应该照药典执行，培养后不超过1/2高度。
58、“无菌性检查中每批培养基随机取不少于5支（瓶）”,这句话中的“5支（瓶）”是5支或5瓶，还是5支和5瓶？”
59、洁净区与阳性实验室空调系统应如何分别设置？送风分离，回风分离，或两者均分离？即2套空调系统？
答：2套系统互不相干。
60、十四烷酸异丙酯若经验证后，不影响阳性菌生长，可否湿热灭菌？答：湿热灭菌的水蒸气可能会影响十四烷酸异丙酯的性能，建议按药典。
61、冲洗液的滤清，加入不浑浊，是否可不用过滤？
62、无菌检查时，阳性对照的接种与培养是否也必须和供试品培养同一天进行？
答：应同步操作。
63、使用的消毒剂应无菌，比如购买的新洁而灭要用无菌的4.5微米滤膜过滤再用吗？
答：如用在关键地方，建议过滤。
64、产品稳定性考察，有无菌检查项目，请问留样产品的无菌检查的数量和常规检查的数量要一样吗？如果是，留样量就会相当大，有的药品比较贵重，这样会造成企业较大的损失.
答：无菌检查的数量和常规检查的数量应一样。
按药典稳定性试验指导原则附表，该做就应做，但若情况特殊，或许可减低检验频次，但如此一来，可能一些药品注册审评专家或GMP检查员会有不同意见。稳定性试验的无菌检查很大程度是在考察包装。
65、 做培养基适用性与方法验证时，若加菌量为100~120cfu＞100cfu，是否需要重新做验证？
66、 药典只是提供了化药中干扰物的中和剂方法，能否提供一些中成药的除菌方法？
67、洁净区污染霉菌怎么处理？
答：可尝试甲醛熏蒸
68、洁净区有霉菌生长，要怎么净化环境？注：我们用75%的乙醇抹洗全部空间，然后开臭氧半小时，但是检测后还是发现有霉菌，老师是不是还有更好的方法？
答：可尝试甲醛熏蒸
69、老师说的酒精棉过一段时间会生长细菌，请问酒精棉保存期多久？
答：未考察，我们使用期一般不超过一周。
70、酒精棉怎样取样进行微生物检查？
答：请自行设计
71、酒精棉有规定超过多少的菌数不能再用？
答：无规定。
72、广州环凯有冻干菌粉卖，是否可以在其单位购买？
答：建议向中检所购买。
73、请问药典说“当产品的组分或原检验条件发生改变时，应对检验方法重新验证”，如何理解“原检验条件发生改变”
答：比如，将冲洗量500ml改为300ml，等等。
74、灵敏度检查：改良马丁和硫乙醇酸性流体培养基都要做6种菌株吗？
答：硫乙醇：4种，为金葡、铜绿、枯草、生孢； 马丁：2种，为百念、黑曲。
75、清洁后的洁具需用微生物纯化水洗涤？
答：清洁后的洁具需用纯化水洗涤。
76、无菌：阳性对照培养48~72小时就可以灭活了吗？不用跟供试品培养14天吗？
77、供试品处理时，需加入适量的聚山梨酯80，聚山梨酯80需要灭菌吗？方法如何？
答：需灭菌，可采用湿热灭菌。
78、含0.05%（v∕v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液如何配制？答：可直接用聚山梨酯80配制，或先配制聚山梨酯80的浓溶液，然后取浓溶液作进一步配制。
79、如何证明“表面活性剂，中和剂或灭活剂使用应有效性及对微生物无毒性”？
答：自行设计
80、抗生素效价室放在洁净室里面是否合适？
答：应与洁净区分开。
81、最后灭菌产品的原辅料是否需要做微生物限度检查？
答；一般情况应做。
82、薄膜过滤法若试验冲洗量1000ml阳性用量多少？
答：也1000ml。
83、无菌用培养基是否不用对照培养基？
84、无菌检查法从开始制样到加入培养基也不能超过1h吗？
答：一般情况应该如此。
85、薄膜过滤法滤膜若＞50mm，冲洗量是否需调整？如何调整？
答：建议按药典规定，选用直径约50mm的滤膜。如要调整，即重新验证。
86、阳性菌接种使用生物安全柜后，那接种室的空调系统能否与微生物限度检查室共用？如果现在共用了，有什么方法能避免交叉污染？
答：请掌握原则，净化系统应分开。
87、怎么消毒在试验中要用的无菌温度计？
答：我们没有这方面的经验。
88、发酵分装容器要预先灭菌，请问分装时是否有要求在无菌的环境下进行，分装后再进行灭菌，程序是否复杂化？
答：我们不明白该问题，一般而言，既然容器要预先灭菌，分装也应无菌操作。
89、无菌检查用的菌悬液是否必须用新鲜培养制备？用于制备菌悬液的培养物可否在25℃条件下连续使用一周？
答：请按药典10版要求，否则，自己验证。
90、饮用水检测中GB标准中“总大肠菌群检出应进一步检验大肠埃希菌或耐热大肠菌群”，是否可以只做大肠埃希菌？
答：我们目前尚未开展水质检验。
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官方公共微信中国药典（2010版）微生物检测 附录XII A 无菌检查法
【摘要】 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生......
附录XII A 无菌检查法
&&&&&&无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
&&&&& 无菌检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。
&&&&&& 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
&&&&& 培养基的制备& 培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2 一25 ℃ 避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1 年内使用。
&& && 1 ．硫乙醇酸盐流体培养基
&&&& 酪胨（胰酶水解）15.0g&&&&&& &酵母浸出粉5.0g
&&& &葡萄糖5.0g&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 氯化钠2.5g
&&&& L-胱氨酸0.5g&&&&&&&&&&&&&&&& &&& &新配制的1 . Oml 0.1％刃天青溶液
&&&& 硫乙醇酸钠0.5g&&&&&&&&&&&&&&&&&& 琼脂0.75g
&&& （或硫乙醇酸）(0.3ml）&&&&&& &水1000ml
&&&& 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH 值为弱碱性，煮沸，滤清，加人葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH 值使灭菌后为7.1士0.2 。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2 , 灭菌．在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ，否则，须经100℃ 水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟）后，迅速冷却，只限加热1次，并防止被污染。
&&&& 2 ．改良马丁培养基
&&&& 胨5.0g&&&&&&& &&&&&& & &磷酸氢二钾1.0g
&& & 酵母浸出粉2.0g &&&&&硫酸镁0.5g
&&& &葡萄糖20.0g &&&&&&& &水l000ml
&&& 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH 值约为6.8 ，煮沸；加人葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4士0.2 ，分装，灭菌。
&&&& 3 ．选择性培养基
&&&& 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。
&&&& 4 ．营养肉汤培养基
&&&& 胨10.0g&&&&&&&&&&&&&& &&&&& 氯化钠5.0g
&&& &牛肉浸出粉3.0g&&&&&&&&& &水1000ml
&&& 取上述成分混合，微温溶解，调pH 值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH 值使灭菌后为7.2士0.2 ，分装，灭菌。
&&&& 5 ．营养琼脂培养基
&&&&& 按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加人14.0g琼脂，调pH 值使灭菌后为7.2 士0.2马丁培养基的处方及制法，加人14.0g琼脂，调pH 值使灭菌后为6.4士0.2，分装，灭菌．培养基的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
&&&&& 培养基的无菌性检查&& 每批培养基随机抽取不少于10 支（瓶）, 5 支（瓶）置30～35℃，另5支（瓶）置20～25 ℃ 培养14 天，均应无菌生长。
灵敏度检查
&&&&& 菌种& 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第O 代），试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性．
&&&&& 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC (B) 26003］
&&&&& 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) [ CMCC (B) 10104］
&&&&& 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501]
&&&&& 生孢梭菌（Clostridium &sporogenes）[ CMCC ( B )64941]
&&&&& 白色念珠菌（Candida &albicans) [ CMCC ( F) 9800l］
&&&&& 黑曲霉（Aspergillusn niger) [ CMCC (F) 98003 ]
&&&&& 菌液制备&& 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35 ℃ 培养18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20～25 ℃ 培养24～48 小时，上述培养物用0.9 ％氛化钠溶液制成每lml 含菌数小于100CFU （菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，23～28 ℃ 培养5～7 天，加入3～5ml 无菌的含0.05 % (ml/ml）聚山梨酯80的0.9 ％氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用无菌的含0.05 ％〔ml/ml）聚山梨酯80 的0.9 ％氯化钠溶液制成每lml 含孢子数小于10OCFU 的孢子悬液。菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用，若保存于2～8 ℃ 可在24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8 ℃ ，在验证过的贮存期内使用。
&&&&&& 培养基接种取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基9 支，分别接种小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 支，另1 支不接种，作为空白对照，置30～35 ℃ 培养3 天；取每管装量为9 而的改良马丁培养基5 支，分别接种小于100CFU 的白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种，作为空白对照，置20～25 ℃ 培养5 天。逐日观察结果。结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
&&&&& 稀释液、冲洗液及其制备方法
&&&&& 稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
&&&&& (1)0.1 ％蛋白胨水溶液&& 称取蛋白胨1.0g ，加水1000ml，微温溶解，滤清，调pH 值至7.1士0.2，分装，灭菌。
&&&&& (2) pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液&& 称取磷酸二氢钾3.56g 、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g, 加水I000ml ，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
&&&&& (3）0.9 ％氯化钠溶液&& 称取氯化钠9.0g ，加水溶解使成1000ml ，过滤，分装，灭菌（仅用于上述2 种溶液不适用时使用）。
&&&&&& 根据供试品的特性可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加人表面活性剂或中和剂等。
&&&&& 方法验证试验
&&&&& 当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证时，按&供试品的无菌检查&的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。菌种及菌液制备同培养基灵敏度检查。薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU 的试验菌，过滤。将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照，细菌置30～35 ℃ 、真菌置20～25 ℃ 培养3～5 天，逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。
&&&&& 直接接种法&& 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8 管，分别接入小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 管，取符合直接接种法培养基用址要求的改良马丁培养基4 管，分别接入小于10OCFU 的白色念珠菌、黑曲霉各2 管。其中l 管接入每支培养基规定量的供试品量，另1 管作为对照，细菌置30～35 ℃ 、真菌置20～25 ℃ 培养3～5 天，逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。
&&&&& 结果判定&& 与对照管比较，如含供试品的各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验且在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验且在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。
&&&&& 验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
供试品的无菌检查
&&&&& 抽验数量 &&&系指一次试验所用供试品最小包装容器的数量（支或瓶）。成品每亚批均应进行无菌检查。除另有规定外，原液、半成品及成品按表1 规定，上市产品监督检验按表2 规定。
&&&&& 接种量 &&&系指每个最小包装的最少取样量（ml或g ）。除另有规定外，接种供试品量按表3 规定。若采用直接接种法，按接种量要求等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中（ 两种培养基的接种支（瓶）数之比为2：1 ) ；若采用薄膜过滤法，应采用三联薄膜过滤器，其中两联加入硫乙醇酸盐流体培养基，另一联加入改良马丁培养基。只要供试品特性允许，应将所有容器内的内容物全部过滤。
&&&& &阳性对照&& 以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查项下金黄色葡萄球菌菌液制备方法，加菌量小于100CFU。阳性对照也可在供试品无菌检查培养14 天后，取其中1 份硫乙醇酸盐流体培养基，加入小于100CFU 阳性对照菌，作为阳性对照。阳性对照置30～35 ℃ 培养48～72 小时应生长良好。
&&&&& 阴性对照&& 供试品无菌检查时，应取相应溶剂、稀释液和冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
&&&& 无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物生长无毒性。
&&&& 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品的& 无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。
&&&&& 操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底梢毒。如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器，取出内容物。
&&&&& 供试品处理及接种培养基
&&&&& 除另有规定外，按下列方法进行。
&&&&& 1 ．薄膜过滤法
&&&&& 采用封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45&m直径约为50mm 。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
&&&&& 水溶性供试品溶液过滤前先将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液粗盖整个滤膜表面。供试品溶液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml ，总冲洗量不得超过l000ml ，以避免滤膜上的微生物受损伤。
&&&&&& 水溶液供试品&& 取规定量，每支（瓶）供试品装量为5ml 及以下者，全部转移至含适宜稀释液100ml 的无菌容器内，混匀，立即过滤；每支（瓶）供试品装量为5ml 以上者直接过滤，或全部转移至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3 次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，2 个滤器中加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml ，另一滤器中加入改良马丁培养基100ml 。
&&&&& 水溶性固体供试品&&& 取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。
&&&& &非水溶性供试品& 取规定量，混合溶于含聚山梨酯80 或其他适宜乳化剂的稀释液300ml的无菌容器内，充分混合，立即过滤。用含0.1 % ～1 ％聚山梨酯80 的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3 次。加入含或不含聚山梨酯80 的培养基。其他照水溶液供试品项下的方法操作。
&&&&&& 可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品&& 取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中，剧烈振摇，使供试品充分溶解。如果需要可适当加热，但温度不得超过44 ℃ ，并趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试品溶液中加入不少于100ml 的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试品溶液过滤。过滤后滤膜冲洗及加入培养基照非水溶性供试品项下的方法操作。
&&&&& 无菌气（喷｝雾剂供试品&& 取规定量，将各容器置至少-20 ℃ 的冰室冷冻约1 小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，并将供试品溶液转移至无菌容器中，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
&&&&& 装有药物的注射器供试品&& 取规定量，将注射器中的内容物（若需要可吸人稀释液或标签所示的溶剂溶解）直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤，然后按水溶性供试品项下方法操作。
&&&&&& 同时应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。
&&&&&& 2 ．直接接种法
&&&&&& 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。取规定量供试品，等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中（2 种培养基的接种支数或瓶数之比为2:1 ) 。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积，不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml ，改良马丁培养基每管装且不少于10ml 。培养基的用量和高度同方法验证试验。
&&&&&& 混悬液等非澄清水溶液供试品&& 取规定量，等量分别接种至各管培养基中。
&&&&&& 固体供试品&& 取规定量，加入适宜的稀释剂溶解，或按标签说明复溶后混合，等量分别接种至各管培养基中。
&&&&& 非水溶性供试品&& 取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80 或其他适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化；等量分别接种至各管培养基中，或等量分别直接接种至含聚山梨酯80 或其他适宜乳化剂的各管培养基中。
&&&&& 培养及观察&& 将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份，一份置30 ～35 ℃ 培养14 天；另一份与接种后的改良马丁培养基置20 ～25 ℃ 培养14 天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14 天后，不能从外观上判断有无细菌生长，可取该培养液转种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌种鉴定。
&&&&& 结果判定&& 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。
&&&&& 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无细菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少1个条件时方可判试验结果无效：
&&&&&& （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。
&&&&&& （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。
&&&&&& （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
&&&&&& 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。
&&&&&&& 表1出厂制品不同规格及原液和半成品量最少抽检数量
批产量（N）；装量（V）
最少抽验数量
冻干血液制品
每柜冻干N&200
每柜冻干N&200
原液或半成品
每个容器取样，取样量为每个容器制品总量的0.1%或不少于10ml。每开瓶1次，应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每批抽验量应不少于3ml
&&&&&& 表2& 上市制品监督抽验数量
品种及装量（V）
最少抽验数量
血液制品& V&50ml
其它生物制品
&&&&& 表3 不同规格制品的最少接种量
每支（瓶）供试品的最少接种量
液体制剂（ml）V&1
原液或半成品
固体制剂M&50mg
50mg&M&300mg
300mg&M&5g
(来源:未知)
(责任编辑：祥子)
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