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我要问一下，英语中的“介词”怎么用？
早、午、晚要用in，at黎明、午夜、点与分。
年、月、年月、季节、周，阳光、灯、影、衣、冒in。
将来时态in...以后，小处at大处in。
有形with无形by，语言、单位、材料in。
特征、方面与方式，心情成语惯用in。
介词at和to表方向，攻击、位置、恶、善分。
日子、日期、年月日，星期加上早、午、晚，
收音、农场、值日on，关于、基础、靠、著论。
着、罢、出售、偷、公、假，故意、支付、相反，准。
特定时日和“一……就”，on后常接动名词。
年、月、日加早、午、晚，of之前on代in。
步行、驴、马、玩笑on，cab，carriage则用in。
at山脚、门口、在当前，速、温、日落、价、核心。
工具、和、同随with，具有、独立、就、原因。
就……来说宾译主，对、有、方状、表细分。
海、陆、空、车、偶、被by，单数、人类know to man。
this、that、tomorrow，yesterday，next、last、one。
早、午、晚要用in，at黎明、午夜、点与分。
年、月、年月、季节、周，阳光、灯、影、衣、冒in。
将来时态in...以后，小处at大处in。
有形with无形by，语言、单位、材料in。
特征、方面与方式，心情成语惯用in。
介词at和to表方向，攻击、位置、恶、善分。
日子、日期、年月日，星期加上早、午、晚，
收音、农场、值日on，关于、基础、靠、著论。
着、罢、出售、偷、公、假，故意、支付、相反，准。
特定时日和“一……就”，on后常接动名词。
年、月、日加早、午、晚，of之前on代in。
步行、驴、马、玩笑on，cab，carriage则用in。
at山脚、门口、在当前，速、温、日落、价、核心。
工具、和、同随with，具有、独立、就、原因。
就……来说宾译主，对、有、方状、表细分。
海、陆、空、车、偶、被by，单数、人类know to man。
this、that、tomorrow，yesterday，next、last、one。
接年、月、季、星期、周，介词省略已习惯。
over、under正上下，above、below则不然，
若与数量词连用，混合使用亦无关。‘
beyond超出、无、不能，against靠着，对与反。
besides，except分内外，among之内along沿。
同类比较except，加for异类记心间。
原状because of,、 owing to、 due to表语形容词
under后接修、建中，of、from物、化分。
before、after表一点, ago、later表一段。
before能接完成时，ago过去极有限。
since以来during间，since时态多变换。
与之相比beside，除了last but one。
复不定for、找、价、原，对、给、段、去、为、作、赞。
快到、对、向towards，工、学、军、城、北、上、南。
but for否定用虚拟，复合介词待后言。
ing型由于鉴，除了除外与包合。
之后、关于、在......方面，有关介词须记全。
in内to外表位置，山、水、国界to在前。
如大体掌握如上介调用法口诀，就不易出错。当然，至于介词的详尽用法，同形词又是连词及副词等内容此章不讲。下面对该口诀分别举例帮助你理解消化。
早、午、晚要用in
例：in the morning 在早上
in the afternoon 在下午
in the evening 在晚上
in the day 在白天
at黎明、午、夜、点与分
例: at dawn, at daybreak 在黎明时候
at noon 在中午
at night 在夜间
at midnight 在午夜
以上短语都不用冠词
at six o"clock 在6点钟
at 7：30 (seven thirty) 在7点半
at half past eleven 在11点半
at nine fifteen 在9点15分
at ten thirty a.m. 在上午10点30分
也可以写成
seven to five 5点差7分(半小时以上)
five minutes after two 2点过5分
at a quarter to two 1点45分
at the weekend 在周末
年、月、年月、季节、周
即在“来年”，在“某月”，在“某年某月” (但在某年某月某
日则用on)，在四季，在第几周等都要用in。
例；in 1986 在1986年
in 1927 在1927年
in April 在四月
in March 在三月
in December 年12月
in July l983 1983年7月
in spring 在春季 in summer 在夏季
in autumn 在秋季 in winter 在冬季
in the fist week of this semester 这学期的第一周
in the third week 在第三周
阳光、灯、影、衣、冒 in，
即在阳光下，在灯下，在树阴下，穿衣、着装、冒雨等都要用in。
例：Don"t read in dim light. 切勿在暗淡的灯光下看书。
They are reviewing their lessons in the bright light. 他们在明亮的灯光下复习功课。
They are sitting in the shade of a tree. 他们坐在树阴下乘凉。
a prisoner in irons 带着镣铐的囚犯
He went in the rain to meet me at the station. 他冒雨到车站去接我。
The poor dressed (clothed) in rags in old society. 旧社会穷人们衣衫褴褛．
以及：in the bright sunlight 在明亮的阳光下
a merchant in disguise 乔装的商人
the woman in white (black, red, yellow) 穿着白(黑、红、黄)色衣服的妇女
in uniform 穿着制服
in mourning 穿着丧服
in brown shoes 穿着棕色鞋
in his shirt sleeves 穿着衬衫
将来时态in...以后
例: They will come back in 10 days. 他们将10天以后回来。
I"ll come round in a day or two. 我一两天就回来。
We"ll be back in no time. 我们一会儿就回来。
Come and see me in two days" time. 两天后来看我。(从现在开始)
after... (从过去开始)
小处at大处in
例：Li and I arrived at Heishan county safe and sound, all is well. Don"t worry. 李和我平安地到达黑山县，一切很好，勿念。
I live in a great city (big city), my sister lives at a small town while my parents live at a village. 我住在大城市，我姐姐住在一个小城镇，而我的父母则住在农村。
I"m in Liaoning, at Anshan. 我住在辽宁省鞍山市．
有形with无形by，语言 、单位、材料in
例：The workers are paving a road with stone. 工人们正用石子铺路。(有形)
The teacher is correcting the paper with a new pen. 这位教师正用一支新笔批改论文。(有形)
"Taking Tiger Mountain by Strategy" is a good opera. &&智取威虎山&&是—出好戏。(无形)
The product is separated by distilation into gasoline and gas oil. 这种产品是用蒸馏分离出气油和粗柴油。 (表示方式、手段、方法——无形)
I really can"t express my idea in English freely in-deed． 我确实不能用英语流利地表达我的思想。 (表示某种语言用in)
I wrote a novel in Russian. 我用俄语写了一本小说。(同上)
The kilometer is the biggest unit of length in the metric system． 公里是米制中最长的长度单位。 (表示度、量、衡单位的用in )
The length is measured in meter, kilometre, and centimetre. 长度是以米、公里、厘米为单位来计算的。(同上)
This board was cast in bronze not in gold. 这个牌匾是铜铸的，不是金铸的。
特征、方面与方式、心情、成语惯用in
特征或状态：
例: The Democratic Party was then in power. 那时民主党执政。
They found the patient in a coma. 他们发现病人处于昏迷状态。
He has not been in good health for some years. 他几年来身体一直不好。
Many who came in despair went away in hope. 许多人带着绝望情绪而来，却满怀希望而去。
The house was in ruins. 这房屋成了废墟。
The poor girl was in tears. 这个贫苦女孩泪流满面。
Her clothes were in rags. 她的衣跟穿破了。
His shoes were in holes. 他的鞋穿出窟窿了。
I only said it in fun. 我说这话只是开玩笑的。
She spoke in grief rather than in anger. 与其说她讲得很气愤，不如说她讲得很伤心。
还有一些短语也用in，如：
in jest 诙谐地，in joke 开玩笑地，in spite 恶意地， in fairness 公正地，in revenge 报复, in mercy 宽大，in sorrow 伤心地等。
His mind was in great confusion. 他脑子里很乱。
Today everybody is in high spirits and no one is in low ebb. 今天大家都兴高采烈，没有一个情绪低落的。
She and her classmates are in flower ages. 她和她的同学都正值妙龄。
The compaign was in full swing. 运动正值高潮中。
例：we accepted the item in principle. 我们在原则上接受了这个条款。
They are never backward in giving their views. 他们从来不怕发表自己的意见。
The backward area has achieved self-sufficient in grain. 这个落后的地区在粮食方面已能自给。
A good teacher must be an example in study. 一个好的教师必须是学习的模范。
例：All the speeches were taken down in shorthand. 所有报告都用速记记录下来了。
The Party has always educated us in the spirit of patriotism and internationalism. 党一贯以爱国主义和国际主义精神教育我们。
如下成语惯用in
例如： in all 总计
in advance 事前
in the meantime 与此同时
in place 适当地
in hopes of(或in the hope of) 怀着.......希望
in connection with 和……有关
in contact with 和……联系
in addition to 除......以外
in case of 倘若，万一
in conflict with 和......冲突
in force 有效的，大批
in depth 彻底地
in regard to 关于
in the neighborhood of 大约、邻近
in retrospect 回顾，一想起
in behalf of 代表......利益
in the least 一点，丝毫
in alarm 惊慌、担心
in the opinion of 据……见解
in the long run 从长远说来
in one"s opinion 在……看来
in word 口头上
in a word 总之
in vain 无益地, 白白地
in case 如果，万一，以防
in detail 详细地
in haste 急急忙忙地
in conclusion 总之
in spite of 尽管
in other words... 换句话说
in return 作为回报
in the name of 以......名义
be confident in 对......有信心
be interested in 对......感兴趣
in doubt 怀疑
in love 恋爱中
in debt 负债
in fun (jest、joke) 玩笑地
in hesitation 犹豫不决
in wonder 在惊奇中
in public (secret) 公开他(秘密地)
in a good humour 心情(情绪)好
“介词at、to表方向，攻击、位置、善、恶、分”。
介词at和to都可以表示方向; 用at表示方向时，侧重于攻击的目标，往往表示恶意；用to表示方向时，突出运动的位置或动作的对象，侧重表示善意。试比较下列各句：
1. A．She came at me. 她向我扑过来。
B．She came to me. 她向我走过来。
2．A．Jake ran at John. 杰克向约翰扑过去。
B．Jake ran to John. 杰克朝约翰跑去。
3．A. He rushed at the woman with a sword. 他拿着剑向那妇女扑过去。
B. He rushed to the woman with a sword. 他带着剑向那妇女跑过去。
4．A．He shouted at the old man. 他大声喝斥那老人。
B. He shouted to the old man. 他大声向那老人说
5．A．I heard her muttering at Xiao Li. 我听见她在抱怨小李。
B．I heard her muttering to Xiao Li. 我听见她在同小李低声说话。
6．A. She talked at you just now. 她刚才还说你坏话呢。
B．She talked to you just now. 她刚才还同你谈话呢.
7．A．She threw a bone at the dog. 她用一块骨头砸狗。
B．She threw a bone to the dog. 她把一块骨头扔给狗吃。
8．A．He presented a pistol at me. 他用手枪对着我。
B．He presented a pistol to me. 他赠送我一支手枪。
日子、日期、年月日，星期加上早午晚; 以下皆用on。
例: on Octorber the first 年10月1日
on February the thirteenth l893 日
on May the first 5月1日
on the first 1号
on the sixteenth 16号
on the second of January 或 on January the second 1月2日
on a summer evening 在夏天的一个夜晚
on Boxing Day 在节礼日(圣诞节次日)
on New Year"s Day 在元旦
on my birthday 在我的生日
但 in the Christmas holidays在圣诞节假期; in the eighteenth century 在十八世纪; in ancient times 在古代; in earlier times 在早期; in modern times 在现代，则用in，the present time 现在，at the present day当今则用at。
on May Day 在“五·一”节
on winter day 在冬天
on Decenber 12th 年12月12日
on Sunday 在星期天
on Monday 在星期一
on Tuesday morning 星期二早晨
on Saturday afternoon 星期六下午
on Friday evening 星期五晚上
但last night 昨夜；in the evening 在晚上; on time准时，in time及时，等则不同。
年月日，加早午晚，of之前on代in
例： on the morning of 18th 18日早晨
on the evening of 4th 4日晚上
On the eve of their departure they gave a farewell banquet and their head gave a garewell speech. 他们在临行前夕举行了一次告别宴会，他们的团长发表了告别讲话。
收音、农场，值日on
例：Did your supervisor like the story over (or on) the radio last night?
您的导师喜欢昨天从收音机里听到的故事吗?
I heard the news over (or on) the radio. 我从收音机里听到了这一条消息。
talk over the radio 由无线电播音
on TV 从电视里......
hear something on the wireless 在无线电里听到
My brother works on an Army reclamation farm. 我哥哥在一个军垦农场工作。
The students are working on a school farm. 学生们正在校办农场劳动。
This is a farmer"s house on a farm. 这是农场的农舍。
Who is on duty, tody? 今天谁值日?
We go on duty at 8 a.m. 我们上午8点钟上班。
关于、基础、靠、著论
例: This afternoon we are going to listen to a report on the international situation. 今天下午我们要听关于国际形势的报告。
Professor Shen will give us a talk on travelling in America. 申教授将给我们做关于美国之行的报告。
You are wrong on all these issues. 在这些问题上你的看法都错了。
The belief is based on practical experience. 这种信念是以实际经验为基础的。
Theory must be based on practice. 理论必须以实践为基础。
The people in the south live on rice. 南方人主食大米。(靠)
The citizens live on their salaries. 城市人靠薪金生活。
You can"t afford luxuries, on an income of 100 yuan a month． 靠月薪100元的收入，你是买不起奢侈品的。
Her pet dogs were fed on the choicest food． 她用精饲料喂养她心爱的狗。
He is just a scrounger, who lives on other people. 他正是一个小偷，专靠损害别人过日子。
Keep the kettle on the boil (=boiling). 让水壶的水一直开着。
The enemy are on the run (=running). 敌人在逃跑。
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各位高手谁能给我详细的讲解一下PCR技术的过程
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聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction）,聚合酶链式反应简称PCR.聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点.它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术.编辑本段发展简史　　人类对于核酸的研究已经有100多年的历史.20世纪60年代末70年代初,人们致力于研究基因的体外分离技术.但是,由于核酸的含量较少,一定程度上限制了DNA的体外操作.Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想.但是,当时的基因序列分析方法尚未成熟,对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现,寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段,这种想法似乎没有任何实际意义. 　　1985年,美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下,经过两年的努力,发明了PCR技术,并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文.从此,PCR技术得到了生命科学界的普遍认同,Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖. 　　但是,最初的PCR技术相当不成熟,在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术.1988年初,Keohanog通过对所使用的酶的改进,提高了扩增的真实性.而后,Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶,使得PCR技术的扩增效率大大提高.也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用,使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石.在以后的几十年里,PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段.到目前为止,PCR技术已有十几种之多,例如,将PCR与反转录酶结合,成为反转录PCR,将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等.编辑本段技术原理　　DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径.双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝.在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链.因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制. 　　但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展.发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床.编辑本段工作原理　　类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时聚合酶链式反应间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40~60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.编辑本段反应特点　　特异性强 　　PCR反应的特异性决定因素为： 　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 　　②碱基配对原则； 　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 　　④靶基因的特异性与保守性. 　　其中引物与模板的正确结合是关键.引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的.聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度.再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高. 　　灵敏度高 　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平.能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌. 　　简便、快速 　　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2～4 小时完成扩增反应.扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广. 　　对标本的纯度要求低 　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板.可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测.编辑本段反应五要素　　参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 　　引物：引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增. 　　设计引物应遵循以下原则： 　　①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右. 　　②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段. 　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列. 　　④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带. 　　⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败. 　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处. 　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性.引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会.编辑本段反应体系与反应条件　　标准的PCR反应体系： 　　10×扩增缓冲液10ul 　　4种dNTP混合物各200umol/L 　　引物各10～100pmol 　　模板DNA0.1～2ug 　　TaqDNA聚合酶2.5u 　　Mg2+1.5mmol/L 　　加双或三蒸水至100ul 　　PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)编辑本段PCR反应条件的选择　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数. 　　温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）. 　　①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃～94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败. 　　②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： 　　Tm值（解链温度）=4(G+C)+2(A+T) 　　复性温度=Tm值-(5～10℃） 　　在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合. 　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子 　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子 　　高于90℃时, DNA合成几乎不能进行. 　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的.3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些.编辑本段酶及其浓度　　目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少. 　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性.dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5,小量分装, -20℃冰冻保存.多次冻融会使dNTP降解.在PCR反应中,dNTP应为50～200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（ 等摩尔配制）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低）,就会引起错配.浓度过低又会降低PCR产物的产量.dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低. 　　模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本.SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增.RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA. 　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜.Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少.编辑本段工作步骤　　PCR反应的基本过程标准的PCR过程分为三步（如图所示）： 　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下, 　　氢键断裂,形成单链DNA 　　2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低,引物与 　　DNA模板结合,形成局部双链. 　　3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活 　　性）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延 　　伸,合成与模板互补的DNA链. 　　每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍. 　　现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.编辑本段循环参数　　1、预变性（Initial denaturation）． 　　模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要,一般95℃加热3-5分钟. 　　2、引物退火（Primer annealing） 　　退火温度一般需要凭实验（经验）决定. 　　退火温度对PCR的特异性有较大影响. 　　3、引物延伸 　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）. 　　延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定. 　　4、循环中的变性步骤 　　循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性： 　　变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败. 　　5、循环数 　　大多数PCR含25-35循环,过多易产生非特异扩增. 　　6、最后延伸 　　在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链. 　　PCR-PCR常见问题编辑本段电泳检测时间　　一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失. 　　假阴性,不出现扩增条带 　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究. 　　模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚.⑤模 板核酸变性不彻底.在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改. 　　酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭. 　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因.有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度 高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单 位.②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决.如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度.③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效.④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等. 　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带. 　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul.或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败.编辑本段物理原因　　变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性；退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率.有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一. 　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的.假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高.引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列.靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性.需重新设计引物. 　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外.除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒.所用离心管及样进枪头等均应一次性使用.必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸.二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性.可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除. 　　出现非特异性扩增带 　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带.非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关.其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增.其对策有：必要时重新设计引 物.减低酶量或调换另一来源的酶.降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数.适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性,65℃左右退火与延伸）. 　　出现片状拖带或涂抹带 　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带.其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起.其对策有：减少酶量,或调换另一来源的酶.②减少dNTP的浓度.适当降低Mg2+浓 度.增加模板量,减少循环次数.编辑本段克隆PCR产物　　1）克隆PCR产物的最优条件是什么? 　　最佳插入片段：载体比需实验确定.1：1（插入片段：载体）常为最佳比,摩尔数比1：8或8：1也行.应测定比值范围.连接用5ul 2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul.室温保温1小时,或4℃过夜.在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑.室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提高连接效率,需4℃过夜. 　　2)PCR产物是否需要用凝胶纯化? 　　如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化.如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体.少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段.为此需在克隆前做凝胶纯化. 　　3）如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验? 　　A）涂布未转化的感受态细胞. 　　如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落. 　　B）转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率. 　　例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化.用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板.培养过夜,产生1000个菌落.转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量. 　　铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数.具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA.转化率为： 　　1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 　　转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞 　　如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低. 　　C）如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞）,表明载体失去T.可能是连接酶污染了核酸酶.T4 DNA连接酶（M,M1794）质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换. 　　D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑,没有菌落或少有菌落,连接有问题. 　　4）对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题? 　　A）连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4℃过夜. 　　B）插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化.为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接.如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备.如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失. 　　C）插入片段不适于连接.用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生.UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化. 　　D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需.加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A.详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）. 　　E）高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞.编辑本段PCR反应的分类SOEing-PCR（重叠PCR）　　重叠区扩增基因拼接法,是基于普通PCR 技术衍生出的一种基因融合和定点突变的有效方法.众所周知,由于引物只需要与模板有效结合,尤其是5’端序列不必与模板完全配对,因此扩增引物的5’端可以添加一种甚至是两种酶切位点,以便于后期克隆.SOEing 法正是利用这一特点,向两个独立基因掺入一段新的序列以达到两个基因出现一个重叠区的目的,3’端的结合使基因融合或定点突变得以实现.RT-PCR（逆转录PCR）　　RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写.逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR）,是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增.
呃，一般都有个pcr仪的dna提取出来后，加入四种核酸原料，引物，聚合酶，Mg2＋缓冲液，放到pcr仪里面。里边加热。降温。加热。降温。。。不断复制扩增，引物所对应的一段特定dna。其实没啥技术含量的。。。。
引物到底有啥作用
聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reactio...
纯粹手打pcr通过pcr仪来实现dna的大量体外扩增 使用pcr仪首先要设计程序一般有以下几个参数1T=94度 00:04:00
94度预变性4分钟2T=x xxxxxxxx
x度变性x时间3T=x xxxxxxxx
x度退火x时间4T=x xxxxxxxx
x度延伸x时间5go to 2 re...}