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《(毕业论文_饲料用油脂新鲜度评价体系的研究打印稿)》
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《(毕业论文_饲料用油脂新鲜度评价体系的研究打印稿)》
官方公共微信鱼油氧化对大口黑鲈幼鱼健康的危害及其控制--《中山大学》2014年博士论文
鱼油氧化对大口黑鲈幼鱼健康的危害及其控制
【摘要】：本论文分五章，从在体和离体水平，分别研究了饲料中鱼油氧化对大口黑鲈幼鱼健康的危害及其控制和丙二醛暴露对大口黑鲈原代培养肝细胞的细胞毒性及其控制。主要结果及结论如下：
1.以新鲜鱼油（过氧化值为11.5meq/kg）和3种不同氧化程度的氧化鱼油（过氧化值分别为132，277和555meq/kg）为脂肪源，设计了4组等氮等脂饲料（分别简称为FR组，OX132组，OX277组和OX555组），通过为期12周的养殖实验，评定了饲料中鱼油氧化对大口黑鲈幼鱼生长、体组成、肝脏抗氧化性能及肝组织结构的影响。实验结束时，OX277组和OX555组均有约3%的大口黑鲈显现了头盖骨或脊椎骨畸形症状，另外，这两个实验组还均有约9%的大口黑鲈显现了背鳍、胸鳍和尾鳍糜烂充血的症状。与新鲜鱼油组相比，饲料中添加氧化鱼油后，氧化鱼油组摄食增加，其增重率和特定生长率因此也增加。饲料中鱼油氧化也会改变大口黑鲈的形态学参数和机体营养组成。摄食氧化鱼油后，大口黑鲈肝脏的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性增加。OX555组肝脏的谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性均高于其它各实验组，而其肝脏的还原性谷胱甘肽（GSH）的含量则低于其它各实验组。氧化鱼油的添加还会导致血浆、肝脏和肌肉的维生素E含量下降，血浆和肌肉的丙二醛含量上升，全血的血细胞比容下降。肝组织切片镜检表明，OX277组和OX555组肝细胞充满脂滴，细胞核偏位甚至消失。本实验结果表明，摄食氧化鱼油导致的氧化损伤刺激了大口黑鲈肝脏的抗氧化防御，削弱了还原性物质储备，并能诱导特征性病理症状的出现。鱼油氧化对大口黑鲈幼鱼健康的危害及其导致的出乎意料的摄食量增加预示着应尽可能防止饲料脂肪氧化的重要性。
2.为了研究维生素E（α-生育酚乙酸酯）和硒（亚硒酸钠）对饲料中鱼油氧化所导致的大口黑鲈幼鱼生长、体组成和肝脏抗氧化性能改变的影响，本实验设计了一个新鲜鱼油对照组和六个氧化鱼油试验组。新鲜鱼油组饲料中含有160mg/kg的维生素E和1.2mg/kg的硒，而氧化鱼油试验组则设置了两个硒梯度，即1.2和1.8mg/kg，并在每个硒梯度下设置3个等级的维生素E，分别为160、280和400mg/kg。12周养殖试验结束时，OxSe1.2/VE160组约有5%的大口黑鲈显现了背鳍、胸鳍和尾鳍糜烂充血的症状。所有实验组的存活率均大于90%，并且各实验组的摄食量相当（88.4-89.6g/fish）。摄食氧化鱼油会导致大口黑鲈幼鱼的生长（增重率和特定生长率）和饲料利用（饲料效率和蛋白质效率）下降，维生素E和硒的额外添加并不能改善生长和饲料利用。另外，维生素E和硒的添加亦不能缓解鱼油氧化所导致的形态学参数指标下降（肝体系数和肠脂系数）。摄食氧化鱼油后，大口黑鲈肝脏的过氧化氢酶活性增加，而添加维生素E后能使其回落至对照组水平。对照组肝脏的GSH含量显著高于OxSe1.2/VE160组，但与其它各实验组相比无显著性差异。肝脏的谷胱甘肽过氧化物酶活性随着饲料中硒含量的增加而增加，而肝脏的维生素E含量则反映了饲料的维生素E水平。与对照组相比，OxSe1.2/VE160组血浆、肝脏和肌肉的丙二醛含量均显著增加，而维生素E和硒的添加均能消除这一现象。本实验结果表明，虽然添加维生素E和硒并不能改善鱼油氧化所导致的大口黑鲈生长性能和饲料利用效率的下降，但能消除鱼油氧化所导致的氧化损伤，有利于大口黑鲈机体健康。
3.本实验目的是为了评价丙二醛暴露大口黑鲈原代培养肝细胞所产生的细胞毒性，通过将1,1,3,3-四乙氧基丙烷在0.1M的HCl中进行酸水解制得丙二醛。待大口黑鲈肝细胞贴壁后，更换含有0（对照组），50，100，250，500和1000μM丙二醛的M199培养基，继续培养24h后，收集培养上清液和贴壁细胞进行后续测定。CCK-8活性测试表明，随着丙二醛暴露浓度的升高，肝细胞的细胞活力呈现剂量依赖型下降。丙二醛暴露浓度超过100μM时，肝细胞的乳酸脱氢酶活性显著增加；而丙二醛的浓度超过500μM时，培养上清液的乳酸脱氢酶活性显著增加。与对照组相比，100μM的丙二醛暴露会诱导肝细胞的过氧化氢酶活性增加，而丙二醛浓度超过250μM时，肝细胞的过氧化氢酶活性反而下降，而肝细胞的超氧化物歧化酶的活性仅在最高浓度的丙二醛（1000μM）暴露时才下降。丙二醛的浓度超过250μM时，大口黑鲈肝细胞的caspase-3和caspase-6的活性增加，肝细胞走向凋亡。丙二醛暴露浓度超过100μM时，培养12h就会导致肝细胞内的活性氧水平上升。细胞内的GSH与氧化性谷胱甘肽（GSSG）的比例随着丙二醛暴露浓度的增加而直线下降。当培养基的丙二醛浓度超过100μM时，肝细胞的硫代巴比妥酸活性产物含量显著增加。本实验结果表明，丙二醛暴露浓度超过250μM时，就会导致大口黑鲈原代培养肝细胞出现氧化损伤和还原性物质储备下降，诱导细胞凋亡发生，细胞活力下降。
4.本实验的目的在于研究维生素E预处理对丙二醛暴露导致细胞毒性的保护作用，使用二甲基亚砜作为维生素E的溶剂。待大口黑鲈肝细胞贴壁后，更换含100、250、500和1000μM维生素E的M199培养基，预处理12h后，加入含有500μM的丙二醛的M199培养基，继续培养24h。同时，本实验还设计了一个正对照组和一个负对照组，即均不添加维生素E进行预处理，但负对照组加入丙二醛暴露肝细胞。与正对照组相比，500μM的丙二醛暴露24h后，肝细胞的活力下降了26.3%，而乳酸脱氢酶活性则增加了37.6%。当维生素E的预处理浓度超过250μM时，肝细胞活力可回升56.3-78.9%；而当维生素E的浓度超过500μM时，乳酸脱氢酶活性回落了64.3-68.6%。丙二醛暴露后，肝细胞的过氧化氢酶活性下降了28.4%，而维生素E（≥250μM）的预处理可以缓解这一现象。另外，丙二醛暴露还会导致肝细胞的GSH含量下降了28.1%，GSSG含量则增加了77.9%，而GSH/GSSG的比例则从4.53下降至2.14，高剂量的维生素E（≥500μM）预处理可以扭转这一现象。丙二醛暴露后，负对照组肝细胞内的活性氧水平增加了26.5%，硫代巴比妥酸活性产物含量增加了52%，超过250μM的维生素E预处理可以扭转活性氧的形成，而超过500μM的维生素E预处理后，脂质过氧化能被缓解52.2-71.6%。而且，丙二醛暴露促使负对照组的caspase-3和caspase-6活性分别增加了77.4%和68.8%，而超过250μM的维生素E预处理可缓解细胞凋亡的发生。本实验表明，培养基中添加超过500μM的维生素E能消除丙二醛暴露大口黑鲈原代培养肝细胞所导致的还原性物质消耗和活性氧的生成，并部分缓解细胞活力的下降及凋亡进程。
5.本实验的目的在于研究维生素C预处理对丙二醛暴露导致细胞毒性的保护作用。待大口黑鲈肝细胞贴壁后，更换含有250、500、μM维生素C的M199培养基，预处理3h后，加入新的M199培养基（含1000μM的丙二醛），继续培养24h。同时，本实验还设计了一个正对照组和一个负对照组，即均不添加维生素C进行预处理，但负对照组加入丙二醛暴露肝细胞。与正对照组相比，1000μM的丙二醛暴露24h后，肝细胞的活力下降了47.7%，而乳酸脱氢酶活性则增加了48.9%。当维生素C的预处理浓度超过1000μM时，肝细胞活力可回升64.6-76.5%；而当维生素C的浓度超过500μM时，乳酸脱氢酶活性回落了54.6-79.3%。丙二醛暴露并不改变肝细胞的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性，而维生素C预处理（≥500μM）后，抗氧化酶活性有增加的趋势。丙二醛暴露还会导致肝细胞的GSH含量下降了39.9%，GSSG含量则增加了70.8%，而GSH/GSSG的比例则从3.17下降至1.31。维生素C的预处理浓度超过500和1000μM时，可分别扭转GSH的消耗和GSH/GSSG比例的下降。丙二醛暴露后，负对照组肝细胞内的活性氧水平增加了36.8%，硫代巴比妥酸活性产物含量增加了43.7%，超过500μM的维生素C预处理可以扭转这些现象。而且，丙二醛暴露促使负对照组的caspase-3和caspase-6活性分别增加了81.1%和57.7%，而超过1000μM的维生素C预处理后，caspase-3的活性回落了97.1-98.2%，caspase-6的活性则回落了51.9-59.9%。本实验结果表明，当维生素C的预处理浓度超过1mM时，能有效预防1mM丙二醛处理所导致的细胞内脂质过氧化，降低细胞内的活性氧水平，增加还原性物质储备，部分缓解细胞的活力下降和凋亡进程。
6.本实验的目的在于研究亚硒酸钠预处理对丙二醛暴露导致细胞毒性的保护作用。待大口黑鲈肝细胞贴壁后，更换含10、25、50和100μM硒的M199培养基，预处理3h后，加入含有1000μM的丙二醛的M199培养基，继续培养24h。同时，本实验还设计了一个正对照组和一个负对照组，即均不添加硒进行预处理，但负对照组加入丙二醛暴露肝细胞。与正对照组相比，1000μM的丙二醛暴露24h后，肝细胞的活力下降了44.7%，而乳酸脱氢酶活性则增加了40.5%。当硒的预处理浓度为25μM时，肝细胞活力可回升33.1%，乳酸脱氢酶的活性则回落了70.1%。丙二醛暴露后，肝细胞的过氧化氢酶活性下降了36.3%，100μM的硒预处理能扭转这一现象。丙二醛暴露还会导致肝细胞的GSH含量下降了32.2%，GSSG含量则增加了53.3%，而GSH/GSSG的比例则下降了50.9%，低浓度的硒预处理可使GSH含量回升36.6-72.2%，而100μM的硒预处理并没有改善效果，同样硒的预处理亦不能缓解GSSG含量的上升，而25μM的硒预处理可使GSH/GSSG的比例回升28.8%。丙二醛暴露后，负对照组肝细胞内的活性氧水平增加了32.1%，硫代巴比妥酸活性产物含量增加了26.3%，25μM的硒预处理可扭转活性氧的形成，并且能使脂质过氧化回落80.8%，但100μM的硒预处理反而加剧了细胞内的脂质过氧化。而且，丙二醛暴露促使负对照组的caspase-3和caspase-6活性分别增加了52.2%和52.7%，而25μM的硒预处理后，caspase-3的活性回落了68.2%，而caspase-6的活性则回落了56.9%。本实验表明，低浓度的硒（10-50μM）预处理能部分缓解丙二醛暴露所导致的细胞毒性，以25μM的效果最佳，但高浓度的硒（100μM）预处理反而会加剧肝细胞的脂质过氧化，诱导细胞毒性的产生。
【关键词】：
【学位授予单位】：中山大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：S943【目录】：
摘要3-8ABSTRACT8-16第一章 引言 脂肪氧化与鱼类健康之综述16-35 1 前言16 2 脂类的营养生理功能16-22 3 油脂的氧化酸败22-25 4 氧化油脂对鱼类的危害25-31 5 预防油脂氧化的措施31-32 6 大口黑鲈的营养需求32-33 7 本论文的目的和意义33-35第二章 饲料中添加氧化鱼油对大口黑鲈幼鱼生长、体组成、肝脏抗氧化防御和肝组织结构的影响35-53 1 前言35-37 2 材料与方法37-42 3 实验结果42-49 4 讨论49-52 5 结论52-53第三章 氧化鱼油饲料中添加维生素E和硒对大口黑鲈幼鱼生长、体组成、肝脏抗氧化防御和肝细胞膜流动性的影响53-72 1 前言53-54 2 材料与方法54-61 3 实验结果61-68 4 讨论68-71 5 结论71-72第四章 丙二醛暴露对大口黑鲈原代培养肝细胞的细胞毒性作用72-90 第一节 大口黑鲈肝细胞原代培养条件的优化72-78
1 前言72-73
2 材料与方法73-75
3 结果与讨论75-77
4 结论77-78 第二节 丙二醛暴露对原代培养大口黑鲈肝细胞的细胞毒性作用78-90
1 前言78-79
2 材料与方法79-81
3 实验结果81-87
4 讨论87-89
5 结论89-90第五章 丙二醛暴露导致大口黑鲈原代培养肝细胞的细胞毒性的防御90-118 第一节 维生素E预处理对丙二醛暴露导致原代培养大口黑鲈肝细胞毒性的保护作用90-100
1 前言90-91
2 材料与方法91-92
3 实验结果92-97
4 讨论97-100 第二节 维生素C预处理对丙二醛暴露导致大口黑鲈原代培养肝细胞毒性的保护作用100-109
1 前言100-101
2 材料与方法101-102
3 实验结果102-107
4 讨论107-109 第三节 亚硒酸钠预处理对丙二醛暴露导致大口黑鲈原代培养肝细胞毒性的保护作用109-118
1 前言109-110
2 材料与方法110-111
3 实验结果111-116
4 讨论116-118全文总结118-119参考文献119-136附录一 缩略词136-138附录二 攻读博士期间发表的论文138-140致谢140-141
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京公网安备74号水产饲料用鱼油掺假多
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　　认清掺假鱼粉、鱼油的真面目
　　在6月25日举行的“珠三角养虾模式创新论坛”上，珠江水产研究所研究员林文辉在发言中提到，对虾养殖的本质是蛋白的转化，即将饲料蛋白转化为对虾蛋白，对虾养殖的效益来自饲料蛋白的转化效率。对于饲料，是要提高蛋白的质量而不是提高蛋白的数量。“养殖户想饲料既有高蛋白又想价格低，是不可能的。高蛋白低价格的蛋白肯定是次蛋白甚至是假蛋白。”
　　曾经“声名大噪”的三聚氰胺就是可以让饲料中蛋白含量虚高。而最近，据广东省饲料行业信息网报道，通威检测中心主任刘耀敏也在公开场合提到，水产饲料用的油脂也有不少掺假现象。他表示，鱼油掺假尤其严重，可用气相色谱法鉴别是否掺有矿物油，用240℃加热减重来鉴别是否掺有生物柴油，若低于2%则为合格。大豆油中若混有棕榈油或动物油脂，可用冰箱冷冻几小时，若出现有白色沉淀，则为混有棕榈油或动物油脂。
　　刘耀敏指出，油脂质量的评价体系有气味、皂化脂、酸价、过氧化脂和丙二醛值，其中丙二醛值是评价动物油脂氧化酸化的指标。通常情况下，辨别油脂步骤先是感官判定，随后可进行克雷斯定性实验，若待测溶液下层呈桃红色或红色，则表示油脂已酸败，下层若呈浅粉红色或黄色则表示未酸败，直接使用或再做后面的化学分析：若酸价高，说明油脂已经水解酸败；若酸价低，过氧化值高，则说明油脂开始氧化或变质；若酸价低，过氧化值低，皂化值高，说明油脂保存得比较好，新鲜度好；若酸价低，过氧化值低，皂化值低，说明油脂严重氧化酸败，已经变质，并存在加碱调低酸价的情况。也可测定油脂电导率来辨别质量，电导率在20以下为较纯的油脂。
　　那么，到底鱼粉、鱼油是通过什么方式掺假，又应该如何鉴别呢？
　　鱼粉掺假识别操作程序
　　1感观检查法
　　1.1视觉
　　优质鱼粉颜色一致，呈红棕色、黄棕色或黄褐色等，细度均匀。劣质鱼粉为浅黄色、青白色或黑褐色，细度和均匀度较差，掺假鱼粉为黄白色或红黄色，细度和均匀变差、掺入风化土鱼粉色泽偏黄。
　　1.2嗅觉
　　优质鱼粉咸腥味、劣质鱼粉为腥臭或腐臭味，掺假鱼粉有淡腥味、油脂味或氨味等异味，掺有棉籽粕和菜籽粕的鱼粉、有棉籽粕和菜籽粕味，掺有尿素的鱼粉，略具氨味，掺入油渣的鱼粉有油脂味。
　　1.3触觉
　　优质鱼粉手捻质地柔软呈鱼松状、无砂粒感、劣质鱼粉和掺假鱼粉手捻有砂粒感、手感较硬、质地粗糙磨手，如结块发粘，说明已酸败，强捻散后呈灰白色说明已发霉。
　　2 物理检验
　　2.1鱼粉中掺有麸皮、花生壳粉、稻壳粉的检验。
　　取3g鱼粉样品置于100ml玻璃烧杯中，加入5倍水，充分搅拌后静置10-15分钟，麸皮、花生壳粉、稻壳粉因比重轻，浮在水面上
　　2.2鱼粉中掺砂子的检验
　　取3g鱼粉样品，置于100ml的玻璃烧杯中，加5倍水，充分搅拌后静置10-15分钟，鱼粉、砂子均沉于底部，再轻轻搅动，鱼粉即浮动起来，随水流转动而旋转，而砂子比重大，稍旋转即沉于杯底，此刻可观察到砂子的存在。
　　2.3鱼粉中植物性蛋白质的检验
　　取适量鱼粉用火燃烧，如发出与纯毛发燃烧后相同的气味，则为鱼粉，而具有炒谷物的香味，则说明其中混杂了植物蛋白质。
　　2.4测容重法
　　粒度为1.5mm的纯鱼粉，容重约为550-600g/l，如果容重偏大或偏小，均不是纯鱼粉。
　　3化学检验
　　3.1鱼粉中掺杂锯末(木质素)的检验
　　将少量鱼粉置于培养皿器中，加入浓度为95%的乙醇浸泡样品、再滴入几滴浓盐酸，若出现深红色，加水后深红色物质浮在水面，则说明鱼粘中掺有锯末类物质。
　　3.2鱼粉中掺淀粉类物质的检验
　　可用碘蓝反应来鉴定，其方法是取试样2.3g置于烧杯中，加入2-3倍水后，加热1分钟，冷却后滴加碘―碘化钾溶液(取碘化钾5g溶于100ml水中，再加碘2g)若鱼粉中掺有淀粉类物质，则颜色变蓝，随掺入淀粉的增加，颜色由蓝变紫。
　　鱼粉中掺入碳酸钙粉、石粉、蛋壳粉的检验可利用盐酸对碳酸盐的反应产生二氧化碳气体来判断，其方法是取试样10g，放在烧杯中，加入2ml盐酸，立即产生大量气泡，即为掺入了上述物质。
　　3.4鱼粉中掺入纤维类物质的检验
　　称取试样2-5g，分别用1.25%硫酸和1.25%氢氧化钠溶液煮沸过滤、干燥后称重，纯鱼粉含纤维量极少，通常不超过1.0%。
　　3.5鱼粉中皮革粉的检验
　　取少许鱼粉样品于培养皿中，加入几滴钼酸铵溶液(以溶液浸没鱼粉为宜)，静置5-10分钟，如不发生颜色变化为皮革粉，如呈现绿色则为鱼粉。
　　钼酸铵溶液的配制，称取5g钼酸铵溶解于100mlH2O中，再加入35ml的浓硝酸即可。
　　3.6鱼粉中掺尿素的检验
　　称取10g样品于烧杯中，加入100mlH2O搅拌、过滤、取滤液1ml于点滴板上，加2-3滴甲基红指示剂(0.1%)再滴加2-3滴尿素酶溶液(0.2%)约经5分钟，如点滴板上呈深红色，则说明样品中掺有尿素。
　　3.7纯/粗蛋白比值鉴别鱼粉掺假
　　甲醛-尿素聚合物是常见的非蛋白氮掺入物，由于尿素以聚合物的形式存在，故用测定游离尿素的方法无法检出，根据纯/粗蛋白比值来推断是否掺有这类高氮化合物，一般认为用纯/粗蛋白的比值80%作为判别鱼粉是否掺有高氮化合物的指标，纯/粗蛋白比值高于80%即没有掺入高氮聚合物。
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