定量产色基质鲎试剂检查药品注射剂内毒素的研究(之一)
作者：刘端华 高丹玲 林秀明 陈引秀
&&&&单位：福州东方鲎试剂厂
&&&&关键词：
&&&&海峡药学990421 目前国内主要用凝胶试管法鲎试剂检查药品注射剂的内毒素，属于半定量的限量试验，不易判断内毒素稀释浓度的准确量值。我国2000年版药典将扩大增加应用品种，首先需要对该品种进行内毒素限值(L)与干扰试验等。我们应用定量产色基质鲎试剂检查药品注射剂内毒素量值，采用内毒素各个稀释浓度的标准曲线进行定量研究，现将研究结果介绍如下。
&&&&1 反应原理
&&&&鲎血中的多功能白色变形细胞内含有能被细菌内毒素激活的凝固酶原、凝固蛋白原与C因子，B因子等。当细菌内毒素先激活C因子，活化C因子再激活B因子，活化的B因子激活凝固酶原成活化凝固酶水解凝固蛋白原使其形成凝固蛋白，产生凝胶[1]。依据此酶分子生化反应的机理，用人工合成产色基质鲎三肽(Boc-leu-Gly-Arg-PNA)作为凝固酶反应底物，利用鲎试剂中被细菌内毒素激活的凝固酶水解鲎三肽中的Arg-PNA之间的结合键，使其游离出PNA(对硝基苯胺呈淡黄色[2][3]。进一步用偶氮试剂使其偶氮化，形成偶氮兰复合物，呈玫瑰色，于波长545 nm比色读数，其产色深浅与内毒素浓度呈线性关系，从而准确地测定出检品中的内毒素含量[4]。
&&&&2 实验材料
&&&&2.1 主要器材
&&&&723型可见分光光度计(上海分析仪器总厂)光度正确度0.5%，石英比色杯光通径1.0 cm，旋涡混合器，恒温水浴箱，定量可调移液器50 μl、100 μl、500 μl、10×75 mm试管。
&&&&2.2 主要试剂
&&&&定量鲎试剂盒(福州东方鲎试剂厂)批号990701，细菌内毒素工作品(福州东方鲎试剂厂)批号0 EU/支，细菌内毒素检查用水规格2 ml/支(福州东方鲎试剂厂)批号990701供试品等。
&&&&3 实验方法与结果
&&&&3.1 检测步骤
&&&&0.05 ml定量鲎试剂+0.1 ml内毒素工作品稀释液/供试品液，于37℃ 30 min后加入0.05 ml鲎三肽再于37℃ 3 min，用0.05 ml NaNO2/HCl混匀后加0.5 ml氨基磺酸铵混匀后，再加0.5 ml萘乙二胺于波长545 nm比色读数。
&&&&3.2 使用器材的予处理
&&&&凡在本检查过程中与鲎试剂液接触的物件、试剂等未被NaNO2/HCl终止反应前均需去除热原。玻璃器材，清洗干净后置于250℃干热4 h；不耐高温和塑料移液吸头等，清洗干净后，再用75%乙醇的2N NaOH溶液浸泡过夜，逐个用无热原水冲洗干净后，置60℃烘箱中烘干备用。
&&&&3.3 标准曲线制订
&&&&3.3.1 细菌内毒素工作品的稀释：取150 EU/安瓿加1.5 ml细菌内毒素检查用水(简称BET)于旋涡混合器上混合15 min，以后每稀释一步均须混合30秒。
&&&&为100 EU/ml10 EU/ml1 EU/ml0.5 EU/ml0.25 EU/ml0.125 EU/ml0.06 EU/ml0.03 EU/ml。
&&&&3.3.2 取系列稀释的最后4个稀释度(即(0.25、0.125、0.06、0.03 Eu/ml)制订标准曲线，每一稀释度平行设2管，再用BET水2管作阴性对照，所有测试管的OD值均需减去阴性对照管OD值后计算浓度，此外要增加大于1 EU/ml内毒素液作阳性对照。
&&&&重复4次，用直线回归方程统计，其相关系数(r)应等于或大于0.98(r≥0.98)其内毒素稀释液OD值的最高最低之差不得小于0.4。
&&&&3.4.3 计算式：
&&&&式中：x轴为内毒素工作品稀释浓度
&&&&y轴为测得的OD值
&&&&内毒素4个稀释度为0.25、0.125、0.06、0.03 EU/ml的OD值分别为0.826、0.436、0.163、0.087，n＝4。
&&&&Σx＝0.465 (Σx)2＝2.162 Σx2＝0.0826
&&&&Σy＝1.512 (Σy)2＝2.2861 Σy2＝0.9065
&&&&r＝0.9978
&&&&Sx＝0.0976 Sy＝0.3342
&&&&斜率＝3.4197 截距＝-0.0195
&&&&4 示例
&&&&4.1 葡萄糖氯化钠注射液
&&&&将原液(A)用BET水1→2倍连续稀释2次即1/2(B)与1/4(C)各加入1.0 EU/ml内毒素工作品稀释液，每稀释一步都要混合30 s，其测试读出OD值，按上述标准曲线公式计算，内毒素浓度结果(见表1)。
&&&&表1 内毒素浓度计算结果 内毒素标准液
&&&&0.0337
&&&&0.0218
&&&&0.0517
&&&&0.0456
&&&&0.0449
&&&&0.1329
&&&&0.1025
&&&&0.1060
&&&&0.1028
&&&&0.2473
&&&&0.2230
&&&&0.2531
&&&&几何均数
&&&&0.0892
&&&&0.0676
&&&&0.0716
&&&&0.0685
&&&&相关系数
&&&&0.9978
&&&&0.9982
&&&&0.9917
&&&&0.9812
&&&&回收率%
&&&&上述结果其相关系数均大于0.98，其最高、最低之差的OD值均大于0.4，合乎标准曲线要求，内毒素的回收率在50%～200%之间[6]可用A组制订的标准曲线来判别。
&&&&4.2 5%葡萄糖注射液：按方法稀释1→2倍，结果(见表2)。表2 稀释1→2倍结果 A
&&&&0.0186
&&&&0.0268
&&&&0.0422
&&&&0.0552
&&&&0.1063
&&&&0.1394
&&&&0.2263
&&&&0.3268
&&&&几何均数
&&&&0.0659
&&&&0.0906
&&&&相关系数
&&&&0.9983
&&&&0.9982
&&&&回收率%
&&&&101.6%
&&&&上述结果表明，其相关系数均大于0.98，其最高最低点OD值大于0.4合乎标准曲线要求。
&&&&内毒素的回收率在50%～200%之间也可用A组制订的标准曲线判别。
&&&&4.3 盐酸阿霉素
&&&&配制成1 mg/ml液体，同上述方法加入1 EU/ml内毒素溶液，制成0.25、0.125、0.06、0.03系列浓度，检测OD值分别为0.801、0.346、0.165、0.063按标准曲线公式计算其内毒素浓度分别为0.240、0.107、0.054、0.024 EU/ml；其几何均值为0.076，相关系数为0.9980其最高点最低点之差大于0.4，符合标准曲线要求，其回收率达到85.2%。
&&&&4.4 妥布霉素样品4个，配制成1 mg/ml溶液检测，分别OD值为0.836、1.006、2.480、0.035、OD值，按上述内毒素工作品标准曲线计算其内毒素量分别为0.25、0.3、0.73、0.16 EU/ml。
&&&&5 讨论
&&&&5.1 用产色基质法鲎试剂制订内毒素标准曲线，应用在葡萄糖氯化钠注射液，5%葡萄糖注射液，盐酸阿霉素，妥布霉素等建立标准曲线与进行回收试验确定内毒素量值明确，达到标准曲线与回收试验的要求[6，7]。
&&&&5.2 所测定的OD值是由分光光度计自动减除阴性对照管。用药液作阴性对照管时，要求选用无检测量内毒素的药液代替阴性水，产色法其测试管OD读数可以阴性对照管排除药液本身以及参予反应试剂本身的污染等使干扰(回收)试验更可靠。
&&&&5.3 从4个未知妥布霉素检品测定结果可见，用产色基质鉴别内毒素含量很明确，其中0.73 EU/ml的OD值为2.483超过仪器限度，将其比色液稀释后再测，可以确定其含量，也可将样本同倍稀释再行检测，无明显偏差。
&&&&5.4 本研究用0.25 EU/ml灵敏度凝胶法鲎试剂作对照，OD值在0.706即0.21 EU/ml时均是坚实凝胶。
&&&&5.5 本研究是将定量产色基质鲎试剂应用于细菌内毒素检查法的扩大应用的药品、生物制品质量控制可行性试验，我们的报告依据只作检测的方法学研究报道和参考，要作为正式代替热原检查应由药品生产厂方提供数据。
&&&&实验指导者：王绍明
&&&&参考文献
&&&&1 Salliven D T，et al：Appl Microbiol )：1023
&&&&2 Yanug.N.s，et al：J Clin Investy 90
&&&&3 Iwanaga.S et al：Halmorstaris 3
&&&&4 原田敏枝一他：医用酵素
&&&&5 T.Obayashi et al：Clin Chem ：55
&&&&6 中国药典2000年版(二部)新增与修订内容汇编(初稿)第347页
&&&&7 Guideline on Validation of，LAL Test as.An End.Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs，Biological Products，and medical Devices.F.D.A.USA，1987；12
(文章出处：海峡药学 1999年第4期第11卷)
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> 实验性大鼠肝硬化血浆内毒素的定量测定及其意义
实验性大鼠肝硬化血浆内毒素的定量测定及其意义
海峡药学 2000年第1期第12卷 药理
作者：高丹玲　刘端华　陈凡
单位：高丹玲（福建省药品检验所　350001）；刘端华（福建省药品检验所　350001）；陈凡（南京军区福州总医院　350025）
关键词：血浆内毒素，大鼠，肝硬化
　　摘要　本文用产色基质偶氮法鲎试剂定量检测实验性大鼠肝硬化血浆中内毒素的含量。结果表明在肝硬化进程中血浆内毒素水平逐渐增高，明显高于正常对照组（P＜0.01），并且血浆内毒素与凝血酶原时间延长呈正相关，与白蛋白水平呈明显负相关，与丙氨酸转移酶不相关。
　　内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖体，目前在药品检验中对细菌内毒素的检测多采用半定量的凝胶法，而在临床检测方面，因血浆的干扰作用，需要更灵敏的方法，我们采用产色基质偶氮法鲎试剂定量测定实验性肝硬化大鼠血浆中的内毒素，报道了10只正常对照组和40只处于不同阶段实验性肝硬化大白鼠的内毒素含量的变化，及肝功能凝血酶原时间的变化，并对其机理进行初步探讨。
　　1　材料与方法
　　1.1　实验动物模型复制和分组：雄性、清洁级Wistar大白鼠50只，体重为162 g～200 g，平均180 g，随机分为肝硬变模型组40只，正常对照组10只，应用多因素综合法制备大白鼠肝硬化模型［1］，并分成3、6、9和12周共4组分批处死大鼠，每次10只，最后1周在光镜下观察到肝组织出现纤维隔，假小叶形成，同时处死对照组。
　　1.2　样本的采集　1.2.1　血浆的制备：严格无菌从大鼠腹主动脉准确抽取血1 ml，注入无热原肝素抗凝管中（15 u．ml-1），加铝盖混匀置于冰水中，迅速低温离心10 min（500转／min），吸出血浆置于安瓿中封口，于-20℃低温保存。1.2.2　肝脏样本：解剖大白鼠，剪取肝组织，用10％福尔马林溶液固定肝脏，取材后石蜡包埋、切片、HE染色、光镜检查。1.2.3　另抽血3～4 ml分别用于检测肝功能及凝血酶原时间。
　　1.3　血浆内毒素含量的测定　1.3.1　仪器：电热鼓风干燥箱NXG101-1型（南京第一医疗器械厂），电热煮沸消毒器（上海市化工进出口公司）、电热恒温水温箱（上海医疗器械厂）、离心沉淀机LXJ-Ⅱ型（福州医疗器械厂）、旋涡混合器Ⅻ-80型（上海医科大学仪器厂）、721分光光度计（上海第三分析仪器厂）、定量移液器若干支。1.3.2　器材去热原处理：玻璃器材清洗干净后要经250℃干热2 h后方可使用。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60℃中烘干备用。1.3.3　试剂配制：显色基质偶氮法鲎试剂盒由上海市医学化验所提供（批号980101），按说明书配制待用。1.3.4　血浆预处理：用于去除鲎试剂的干扰因子。取离心后血浆0.1 ml，加入配套的无热原生理盐水0.2 ml，Tris-HCL缓冲液0.2 ml混匀，置于100℃水浴加热10 min，3000 rpm离心10 min，取上清液检测。1.3.5　检测步骤：吸取50μl鲎试剂于小试管中，加入100 μl的预处理样品（或内毒素稀释液，或空白对照液），于37℃水浴25 min取出，在冰水浴中加入鲎三肽50 μl，于37℃水浴3 min。取出后在冰水中加入500μl亚硝酸钠盐酸溶液终止反应，然后顺次加入氨基磺酸铵及萘乙二胺溶液各500μl进行显色反应，后于波长545 nm处比色读数，测得吸光度值As。1.3.6　标准曲线的制定：每次试验均制备标准曲线，在冰水浴中将配套内毒素稀释成系列浓度（0.008，0.015，0.031，0.063，0.125，0.250 eU．ml-1），同时以无热原盐水作对照管，照1.3.5所述方法测出各浓度内毒素溶液所对应的吸光度值A及空白对照管Ab1，以内毒素浓度为横座标，所对应的A-Ab1值为纵坐标，得出回归直线方程Y＝ax＋b，截距b应近似于零，相关系数r＞0.99。1.3.7　血浆样品的空白对照管：取100μl预处理样品，加入无热原盐水100 μl，再加入反应终止液500μl，后与其它检测管一同加入显色剂，比色测得Ab2。1.3.8　内毒素回收率试验：用适当的方法，使预处理样品中内毒素含量为0.2 eu／ml，并随同样品管一起照1.3.5方法测得吸光值，在扣除试剂空白管Ab1及血浆空白管Ab2后代入直线方程，求得的内毒素值再除以0.2 eU．ml-1即得，回收率约为50％。1.3.9　含量计算：设样品的吸光度值为y。
　　y＝As-Ab1-Ab2，将y代入直线方程求得内毒素含量x，结合回收率再乘以5（5为加热稀释法去除抑制因子时的稀释倍数），算出样品所含的内毒素值（EU／ml）。若y值超出标准曲线范围，可将样品稀释后再测。
　　2　结果
　　2.1　动物模型　经病理证实在注射CCL43周后，光镜下病理表现以中毒性肝炎为主，注射6周后，光镜下病理表现以肝纤维化为主，注射9周后，光镜下病理表现以早期肝硬化为主，注射12周后，表现以肝硬化为主。
　　2.2　肝功能及凝血酶原时间　CCL4诱发大鼠肝硬变不同时期及正常对照大白鼠的肝功能及凝血酶原时间（见表1）。
表1　各组大鼠的肝功能及凝血酶原时间（±S，n＝10）
凝血酶原时间
　　（g．L-1）
丙氨酸氨基转移酶
12.09±1.18
28.51±1.91
47.09±11.54
12.26±1.17
26.29±2.41
50.11±14.23
14.39±1.48
24.51±1.55
49.43±13.12
14.81±3.08
16.04±2.54
49.81±12.26
18.51±4.15
14.46±1.23
51.67±13.89
　　2.3　血浆内毒素含量变化　CCL4诱发大鼠肝硬变不同时期及正常对照大白鼠血浆内毒素的含量（见表2）。
表2　各组大鼠的血浆内毒素含量变化
内毒素(EU．ml-1)
　　(与正常对照组比较)
　　P＜0.01
　　4组肝硬变大鼠不同时期（3周、6周、9周、12周）的血浆内毒素浓度依次为0.5、0.8、0.8、0.0 eU．ml-1，均不同程度高于健康对照组0.2 eU．ml-1（P＜0.01），随病情加重，血浆内毒素浓度呈上升趋势，且相差显著（P＜0.01）。
　　2.4　血浆内毒素与实验性肝硬化的关系　直线相关分析表明：在肝硬变进程中，大鼠血浆内毒素与血白蛋白浓度呈显著负相关（r＝－0.514，P＜0.01），与凝血酶原时间延长呈显著正相关（r＝0.412），与丙氨酸氨基转移酶之间无相关关系。3　讨论
　　3.1　由于血浆中含有对鲎试验的干扰因子，所以对血浆进行预处理以去除干扰因子是很必要的，目前主要采用稀释加热法和过氯酸新法［3］，过氯酸新法的回收率可达90％以上，较稀释加热法高，但操作较复杂。本实验采用稀释加热法，并在每组实验中包含回收率实验和标准曲线的制订，即可获得精确可靠的数据。本实验中用产色基质偶氮鲎试剂法最低可检测内毒素含量为0.008 eU．ml-1的样品。该法所需的仪器简单，操作中注意避免污染并严格掌握实验温度，内毒素稀释与加样均应在冰水浴中进行，以保证实验良好的精确性和重现性。
　　3.2　内毒素是由蛋白质、类脂、多糖组成的异质多聚体，多见于革兰氏阴性杆菌和球菌，其主要成份脂多糖（LPS）是类脂和多糖的复合体，LPS具有广泛的生物活性，肝脏在清除内毒素中起重要作用，肝硬化时内毒素血症十分常见，不伴感染的患者也常发生，究其原因，可能为［4］：①肝硬变时枯否细胞清除能力下降或由于肝内组织结构和血液的改变，使内毒素不能与枯否细胞充分接触，加上门脉高压侧支循环开放，均使内毒素不能在肝内清除或绕过肝脏进入体循环；②肝硬变时肠道蠕动功能下降，细菌异常增殖，产生大量内毒素，肠道粘膜瘀血水肿且通透性增加，加上特异性IgA分泌减少而结合处理内毒素能力下降，细菌和内毒素易于吸收；③机体免疫功能下降，调理素、IgM等不足或功能减弱，出现低补体血症，使进入体循环的内毒素不易及时清除；④肝病患者极易发生革兰氏阴性细菌血症或败血症，肝外革兰氏阴性细菌也容易伴发内毒素血症。近年来研究表明，内毒素血症在肝功能不全发展为肝功衰竭中起决定性作用，与黄疸出血，功能性肾衰和肝性脑病的发生密切相关［5］。本研究结果表明，CCL4诱发大鼠肝硬变不同期间，血浆内毒素水平明显高于正常组，并逐步上升，而且升高的水平与肝功能受损的程度呈正相关，与上述理论、观点相一致。还提示：肝功能状况决定内毒素水平，而内毒素血症可加重肝功能损害。
　　参考文献
　　［1］Chatmamra K.et al：Phenobarbitone-Induced enlargement of the liver in the rat：its relationship to carbontetrachloride-induced cirrhosis，Br J Exp Path 3～288
　　［2］王绍明等：定量检测微量内毒素技术探讨上海医学检验杂志）∶152～154
　　［3］陈有为等：过氧酸处理血浆检测内毒素的鲎试验定量法及血浆EIA的测定中华医学检验杂志1989；（1）∶24
　　［4］黄自平等：肝病时的内毒素血症。见梁扩寰主编。肝脏病学，第1版，北京，人民卫生出版社，～411
　　［5］韩德五：内毒素与肝功能衰竭新消化病学杂志-2
　　［6］Obayashi T，：Addition of perchloric acid to blood samples for colorimetric limulus test using chromagenic substrate：comparison with conventional procedures and clinical applications，J Lab Clin Med ∶321～330
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3秒自动关闭窗口血浆内毒素定量测定在临床上的意义--《检验医学与临床》2011年11期
血浆内毒素定量测定在临床上的意义
【摘要】：正细菌内毒素为革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖成分,而在临床表现上,由革兰阴性菌所引起的内毒素血症及脓毒血症目前仍是临床上的主要死亡原因之一[1]。虽然人们使用了各类广谱、高效的抗生素,但是脓毒血症的病死率仍居高不下。作为临床早期诊断的细菌学培养,不仅需时很长,而且由于抗生素
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R446.1【正文快照】：
细菌内毒素为革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖成分,而在临床表现上,由革兰阴性菌所引起的内毒素血症及脓毒血症目前仍是临床上的主要死亡原因之一[1]。虽然人们使用了各类广谱、高效的抗生素,但是脓毒血症的病死率仍居高不下。作为临床早期诊断的细菌学培养,不仅需时很长,而且由
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