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蛋白酶活性的测定
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基于酸性蛋白酶的新型蛋白饲料研究.pfg.pdf 74页
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西南交通大学硕士研究生学位论文
酸性蛋白酶(Acidprotease)是一种适合在酸性条件下水解蛋白质的酶
类，它已被广泛的应用于食品、酿造、皮革、胶原纤维和饲料工业等诸多行
业。而近年来酸性蛋白酶作为一种新型饲料添加剂的应用得到人们的广泛重
本论文以米曲霉菌株和酵母菌CHC一3、DSF—l、GY一1为出发菌株，通过米
曲霉菌株的筛选、生产酸性蛋白酶最佳培养基的优化、酵母菌培养基的优化
以及混合固态发酵工艺的研究，获得一条富含小肽的新型蛋白饲料生产工艺。
并对所产新型蛋白饲料进行仔猪饲喂试验以及对米曲霉所产的酸性蛋白酶进
行分离纯化获取相关酶学信息。
实验以米曲霉A一29和A一79等菌株为出发菌株，进行发酵培养和产酶
菌株的筛选，发现菌株A一29生产酸性蛋白酶能力较强。进一步通过正交实
验方法对A一29菌株酸性蛋白酶生产的培养基组成进行研究，结果表明，米
51．45％的固体培养基上所产酸性蛋白酶活力最高，发酵温度为30℃，最适发
酵时问为72h。同时通过培养基优化实验发现，获取酵母菌CHC一3、DSF一1、
GY一1最大生物量的最适混合液态发酵培养基为：麸皮5％、玉米糖浆85．2％
时间为24h。进一步以麸皮和豆饼粉为主要底物进行混合固态发酵工艺研究，
量8％的新型蛋白饲料。饲喂试验表明，仔猪料肉比(平均耗饲料kg／kg
肉)明显低于对照组，经济效益良好。
Flow离子交换层析、
最后经过硫酸铵盐析、脱盐、DEAE--Sepharose
化水平已达电泳纯，分子量约为45Kd。
关键词：米曲霉，酸性蛋白酶，固态发酵，小肽饲料，饲喂试验，蛋门纯化
西南交通大学硕士研究生学位论文
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condition(pH1～5)．It
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inthefodderwere
investigated．Atechnique
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proteasedspergiliusoryzae p
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基于酸性蛋白酶的新型蛋白饲料研究
西南交通大学研究生学位论文基于酸洼蛋白酶的新型蛋白饲料研究年 姓级名二ｏｏ四级 刘超 理学硕士申请学位级别专业 生物化学与分子生物学指导教师奎堂塑整撞二ｏ ｏ六年十一月西南交通大学硕士研究生学位论文第１页摘要酸性蛋白酶（Ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）是一种适合在酸性条件下水解蛋白质的酶 类，它已被广泛的应用于食品、酿造、皮革、胶原纤维和饲料工业等诸多行 业。而近年来酸性蛋白酶作为一种新型饲料添加剂的应用得到人们的广泛重视。本论文以米曲霉菌株和酵母菌ＣＨＣ一３、ＤＳＦ―ｌ、ＧＹ一１为出发菌株，通过米 曲霉菌株的筛选、生产酸性蛋白酶最佳培养基的优化、酵母菌培养基的优化 以及混合固态发酵工艺的研究，获得一条富含小肽的新型蛋白饲料生产工艺。 并对所产新型蛋白饲料进行仔猪饲喂试验以及对米曲霉所产的酸性蛋白酶进 行分离纯化获取相关酶学信息。 实验以米曲霉Ａ一２９和Ａ一７９等菌株为出发菌株，进行发酵培养和产酶 菌株的筛选，发现菌株Ａ一２９生产酸性蛋白酶能力较强。进一步通过正交实 验方法对Ａ一２９菌株酸性蛋白酶生产的培养基组成进行研究，结果表明，米 血霉Ａ一２９在豆饼粉７．５％、（ＮＨ）：Ｓ０４０．８％、水４０％、Ｉ（Ｈ：ＰＯｔ０．２５％、麸皮 ５１．４５％的固体培养基上所产酸性蛋白酶活力最高，发酵温度为３０℃，最适发 酵时问为７２ｈ。同时通过培养基优化实验发现，获取酵母菌ＣＨＣ一３、ＤＳＦ一１、 ＧＹ一１最大生物量的最适混合液态发酵培养基为：麸皮５％、玉米糖浆８５．２％ （糖度１１％）、豆饼粉９％、（ＮＨ。）。Ｓ０４０．８％。所用三株酵母菌ＣＨＣ一３：ＤＳＦ一１： ＧＹ－１以３：４：２的比例接种，总接种量控制在９％，发酵温度为３０。Ｃ，发酵 时间为２４ｈ。进一步以麸皮和豆饼粉为主要底物进行混合固态发酵工艺研究， 结果在３０℃条件Ｆ混合固态发酵３６ｈ，获得了酸性蛋白酶活力１４４０Ｕ／ｇ，酵母 菌数６．２９×１０９个／ｇ，粗蛋白含量７０．５６％，小肽分解率１０．１２％，还原糖含 量８％的新型蛋白饲料。饲喂试验表明，仔猪料肉比（平均耗饲料ｋｇ／ｋｇ 肉）明显低于对照组，经济效益良好。 最后经过硫酸铵盐析、脱盐、ＤＥＡＥ－－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＳｅｐｈａｃｒｙ ＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析、ｓ一２００分子筛层析提取了酸性蛋白酶，并经ＳＤＳ－－ＰＡＧＥ验证该酶纯化水平已达电泳纯，分子量约为４５Ｋｄ。 关键词：米曲霉，酸性蛋白酶，固态发酵，小肽饲料，饲喂试验，蛋门纯化西南交通大学硕士研究生学位论文第１Ｉ页ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅ ａｃｉｄｐｒｏｔｅａｓｅｉＳａｋｉｎｄｏｆｅｎｚｙｍｅｔｈａｔｉＳＳＵｉｔａｂｌｅｆｏｒ ｈａｓｈｙｄｒｏｌｙｓｉＳｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ａｌｒｅａｄｙ ｂｅｅｎ ａｐｐｌｌｅｄ ｉｎ ｆｕｒ ａｎｄａａｃｉｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（ｐＨ １～５）．Ｉｔａｓｌｏｔ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ｓｕｃｈｆｏｏｄ，ｂｒｅｗｉｎｇ，ｌｅａｔｈｅｒ，ｃｏｌ ｌａｇｅｎｆｉｂｅｒ ａｎｄ ｆｏｄｄｅｒ，ｅｔｃ．Ｉｎ ｔｈｉＳ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｏｒｙｚａｅ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｉｎ ｔｈｅｐＯＳＳｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＵＳｉｎｇ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｄｄｅｒｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａｎｅｗｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒｗａｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｅｅｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｏｔｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｃｉｄｐｒｏｔｅａｓｅｇｏｔ．Ｔｈｅｓｏｍｅｏｆｄｓｐｅｒｇｉｌｉｕｓｏｒｙｚａｅｗａｓｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｉｔｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｔｅｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆｂｅｔｔｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ａｓｐｅｒｇｉ］ｌｕｓｔｈｅ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅＡ一２９ｔｈａｎｏｒｙｚａｅ Ａ－７９ｓｕｉｔａｂｌｅｍｅｄｉｕｍｗａｓ ａｓ５１．４５％ｏｆ ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ，７．５％ｏｆ ｂｅａｎ ｃａｋｅ ｐｏｗｄｅｒ，０．８％ｏｆｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＮＨｄ）２Ｓ０４，０．２５％ｏｆ ＫＨ２ＰＯｄａｎｄ ４０％ｗａｔｅｒ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔｓｗａｓ ｗａｓｏｆｔｅｓｔｅｄ ｔｏａｉｎｃｕｂａｔｅｄ ａｔ３０℃ｆｏｒ ７２ ｈｓ．Ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ．９％ｂｅａｎ ｃａｋｅｍｉｘｔｕｒｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５％ｏｆｐｏｗｄｅｒ．０．８％ｏｆ（Ｎｉｔ４）２Ｓ０４ ａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ１１％ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｓｕｇａｒ．Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗａｓ３０℃．Ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ２４ｈ，ｔｈｅ ｙｅａｓｔＳ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍｔｈｅｍｏｓｔ．Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｇｈ―ｐｒａｔｅｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｗａｓｆｅｅｄ（ＨＰＢ一１）ａｄｄｉｎｇ ７．５％ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉ］ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ａ－２９ｔａｎｅｋｏｊｉａｎｄ ９％ｏｆ ｙｅａｓｔｗａｓｍｉｘｔｕｒｅｃｕｌｔｕｒｅ（ｔｈｅｒａｔｉ０ ｏｆ ＣＨＣ一３。ＤＳＦ一１ ａｎｄ ＧＹ一１３：４：２）ｔｏｔｈｅ ＳＳＦ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２５％ｏｆ ｂｅａｎ ｃａｋｅ ｐｏｗｄｅｒ ａｎｄ ２５％ｏｆ ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ａｔ ３０℃ｆｏｒ ３６ｈｓ．Ｔｈｅ ＨＰＢ一１ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅｅｎｚｙｍｅ（１４４０Ｕ／ｇ），ｔｈｅ ｙｅａｓｔｓ（６．２９ ａｍｉｎｏａｃｙｉ（７７．７ｍｇ／ｇ），ｔｈｅ （０．０８９／ｇ）．ＨＰＢ―１ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗａｓＸ１０９／ｇ），ｐｒｏｔｅｉｎ（０．７０５６９／ｇ），ｔｈｅｒｅｄｕｃｉｎｇｓｕｇａｒｐｅｐｔｉｄｅｓ（０．１０１２９／ｇ）ａｎｄｕｓｅｄｔｏｆｅｅｄ ｐｉｇｓ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｄａｉｌｙｇａｉｎ ｐｅｒ ｈｅａｄ ｔｈａｔｏｆ ｏｆｇｒｏｕｐ ｗａｓ４１４．２９９／ｄ，ｉｔｒｅｓｕｌｔｓｗａｓ８８．５８ ｇ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ｐｉｇｓｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ＨＰＢ一１ｗａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ｔｈａｔ ｏｆｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ．ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎｗａｓｆｅｅｄｉｎｇ ｔｈｅＴｈｅ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅｅｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｅｐｓ ｏｆ西南交通大学硕士研究生学位论文ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ第１ＩＩ页Ｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＤＥＡＥ―ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ一２００ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｉｔｓ ｐｕｒｌｔｙｗａｓ ｗａｓｃｈｅｃｋｅｄ ｔｏ ｂｅ ａｂｏｕｔ ａｂｏｕｔ ４５ＫＤ．ａｓｉｎｇｌｅ ｂａｎｄ ｂｙ ＳＤＳ～ＰＡＧＥ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔＫｅｙｗｏｒｄｓ：ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａＢ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｅｅｄ，ｆｅｅｄｉｎｇ ｔｅｓｔ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ西南交通大学硕士研究生学位论文第１页第１章综１．１酸性蛋白酶１．１．１酸性蛋白酶性质述酸性蛋白酶（Ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）是一种适合在酸性条件下水解蛋白质为小肽 和氨基酸的酶类。酸性蛋白酶最早发现于２０世纪初，一般包括胃蛋白酶、凝 乳酶和一些微生物蛋白酶。其中微生物所产的酸性蛋白酶是研究和应用最为 普遍的一种，已广泛应用于食品、酿造、毛皮与皮革，胶原纤维等行业中． 而在饲料行业中多采用酸性和中性蛋白酶，以提高动物对蛋白质的水解效率， 促进动物对饲料蛋白质的吸收效率．酸性蛋白酶作为饲料添加剂可追溯到２０ 世纪５０年代，Ｊｅｎｓｅｎ及９ｒｙ等报道的添加粗制酸性蛋白酶制剂到大麦日粮中， 提高鸡的生长速率和饲料的转化效率Ⅲ．酸性蛋白酶分解蛋白质的条件与动 物体内消化系统的环境相似，故可通过提高动物对蛋白质的水解效率的方式， 加强畜禽对蛋白质的消化吸收率，以取得良好的喂养效果Ⅱ】． 微生物蛋白酶的一个显著特点是具有多样性和复杂性，通常一林微生物可 能分泌２～３种蛋白酶。霉菌甚至可分泌３～４种蛋白酶，即使属于同一菌种， 其蛋白酶的种类和数量几乎是每一个菌株都不相同。目前发现的能分泌酸性蛋白酶的菌株主要是各种霉菌。如曲霉、根霉、青霉等。不同微生物菌种分 泌的酸性蛋白酶在底物特异性、抑制剂，激活剂等方面均存在着一定的差异性。但它们在很多方面也具有一定的共同的特性： （１）ｐＨ值适应性酸性蛋白酶作用的最适稳定ｐＨ范围２．Ｏ～４．Ｏ之间。最适ｐＨ３．０。ｐＨ低于２．０，高于４．Ｏ将影响水解速度。但不同微生物的酶稍有差异。根霉属一般ｐＨ３．Ｏ左右；曲霉属一般在３．０以下；而黑曲霉产生的Ａ型和Ｂ型酸 性蛋白酶，其最适ｐＨ都为３．０；青霉属的酶在３．Ｏ～４．Ｏ的范围，如紫青霉 （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇ）为３．０，灰绿青霉为３．５，而青霉分泌的门冬氯酸蛋白 酶为３．４．酵母菌产的孢内酸性蛋白酶，可通过酵母细胞自溶而释放到外环境 中，其性质与黑曲霉产的Ａ型蛋白酶性质相近，最适ｐＨ也在３．０１８口】．曲霉和 根霉所分泌的酸性蛋白酶一般在ｐＨ２．Ｏ～６．０比较稳定，在ｐＨ６．Ｏ以上，容易失 活，酸性蛋白酶对ｐＨ值的这种要求，可能与酶活性中心含有一个或两个羧基 有关。西南交通大学硕士研究生学位论文第２页（２）温度适应性酸性蛋白酶一般在５０℃以下可保持稳定，但也随产酶 的微生物菌种不同而有所差异．如曲霉属的斋滕曲霉所产的酶在５０℃仍稳定，但在５５℃处理ｌＯ分钟就失活，而根霉属的蛋白酶在３０．ｃ下只能保持３０分钟。 青霉属产的门冬氨酸蛋白酶，在最适ｐＨ条件下，在５０℃可达到最大酶活，酵母菌产的酸性蛋白酶经过６０℃处理只剩极少活力，而在７０℃则完全失活“１．（３）抑制剂一般来说，酸性蛋白酶的抑制剂主要是重氪酮化合物和十二烷基硫酸钠。霉菌酸性蛋白酶通常并不受胃蛋白酶抑制剂对一溴苯的抑制，但 却对Ｎ一溴代琥珀酰亚胺和高锰酸钾敏感。此外，并非每种酸性蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制剂（ｓ―ＰＩ）抑制，如黑曲霉产的蛋白酶Ａ１、Ａ２和Ｓｃｙｔａｌｌｄｌｕｍｌｉｇｒｃｏｌｕｍ产的蛋白酶Ｂ对其均不敏感。青霉属的Ｐｅａｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ．Ｐｅｎ．Ｊｅａｔｈｉｎｅｌｌｕｍ以及根霉属的中华根霉（Ｒｈｉｚａｐｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）产的酶见光会被２，３－－丁二酮作用而失活，可能与其 蛋白酶的活性部位为酪氨酸及色氨酸有关。另外，沙门伯干酪青霉 （Ｐｅｎｉｅｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）产的门冬氨酸蛋白酶可被ｌ，２一环氧一３一（对一 硝基苯）丙烷（ＥＰＮＰ）、重氮乙酰ＤＬ－－亮氨酸甲酯（ＤＡＮ）及胃蛋白酶抑制剂所抑 制，这与门冬氨酸蛋白酶中的羧基在其催化反应中起关键作用有关。 （４）金属离子对酶活力的影响酸性蛋白酶可被Ｍｎ”、Ｃａ”、Ｍ９２＋离 子激活，被Ｃｕ”、Ｈｇ”、Ａ１２＋离子抑制，液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐 中将失活较多。１．１．２我国酸性蛋白酶工业生产概况微生物酸性蛋白酶国外从２０世纪６０年代就开始研制，而我国１９７０年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选一株３．３５０产酸性蛋白酶菌株，并和上 海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。由于３．３５０ 酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂，１９７７年被中国科学院微生 物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变，筛选 的５３７高产酸性蛋白酶菌种取代“’．目前国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上 都是用５３７酸性蛋白酶菌种生产，发酵酶活力一般在６０００～７０００ｕ／ｍＬ，成品 剂型有工业级的粉剂，食品级的粉剂和浓缩剂，成品的酶活力有５万ｕ／ｇ、４ 万ｕ／ｇ、２万ｕ／ｓ（ｍＬ）。”’ 我国最早利用微生物所生产的酸性蛋白酶，主要用于皮毛软化，属于工 业级的酸性蛋白酶“’．但随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用， 最近几年已生产出食品级酸性蛋白酶制剂。食品级酸性蛋白酶生产工艺的前西南交通大学硕士研究生学位论文第３页期发酵过程与工业级酸性蛋白酶生产工艺的发酵过程相同，只是在后期提取 工艺中有所不同．１．１．３酸性蛋白酶制剂与饲料工业随着畜牧业的发展，对蛋白质饲料的需求也与日俱增，但我国的蛋白质 资源远远不能满足日益发展的畜牧业需要。每年都花费大量外汇进口鱼粉。 因此广大科技工作者利用玉米淀粉渣、玉米酒精糟（ＤＤＧ）、秸杆、皮、壳、芯等可再生资源通过微生物的转化作用，将其中的纤维物质合成菌体蛋白，提高饲料质量，满足畜牧业对蛋白质饲料的需求。 其中，１９８７年山西省农科院玉米研究所利用白地霉固体发酵生产酒糟单 细胞蛋白饲料，粗蛋白质达３９．７２％，使用该饲料饲喂肥猪平均增重５３４９， 每增重Ｉｋｇ比对照组提高０．Ｉｋｇ，饲料利用率提高１１．０８％ｎ１． 为了提高固体发酵生产单细胞蛋白的含量，不少厂家通过加入酸性蛋白 酶促进菌体生长，此法可增加蛋白含量４％～１０％。具体方法为：将酸性蛋白 酶制剂（食品级或饲料级的）按每克固体发酵配料中的豆饼粉加入１０～２０单 位，计算所需蛋白酶的用量，称量后溶于２０倍的清水中（最好灭过菌的水）活 化半个小时，同菌种一同泼散到灭过菌冷却到接种温度的料醅中，拌均后入 池发酵。另外有的厂家取出配料中部分豆饼粉（视配料中豆饼粉的多少），按豆饼粉重量，以１：３０溶于水中，１００℃煮沸，冷却至４０℃，调ｐＨ３．０，加入适当 量的酸性蛋白酶水解４ｈ，同种子一起泼散到配料中，发现效果更好ｎ”． 饲用酸性蛋白酶的应用效果主要表现在以下方面：酸性蛋白酶对饲料蛋 白质有明显的降解作用，而且在非常规蛋白饲料中的应用效果要优于常规蛋 白饲料，对不易消化物质更具独特的催化作用。幼年动物因其消化器官分泌 的酶系和酶量（内源酶）不足，对饲料蛋白质消化能力较差，极易引起消化不 良、腹泻与消瘦等疾病ｎ”。因此，国外营养学者很早就将酶制剂作为饲料添 加剂加以应用，并证实在饲料中添加蛋白酶（外源性消化酶），有利于提高饲料中蛋白质的可消化性。在２０世纪５０年代，Ｊｅｎｓｅｎ等（１９５７）和Ｆｒｙ等（１９５８）曾报道，添加粗制蛋白酶制剂到大麦日粮中，可显著提高鸡的生长速度和饲 料转化率。同时，酸性蛋白酶用于乳猪和早期断奶仔猪，对提高猪的生长速 率也有显著作用。 酸性蛋白酶是一种消化酶，一般不单独使用，都是以复合酶的形式做为 饲料添加剂加入饲料。根据不同动物和同一种动物不同发育阶段以及饲料中西南交通大学硕士研究生学位论文第４页蛋白质含量多少来确定酸性蛋白酶用量配制复合酶制剂。复合酶制剂主要成 份有酸性蛋白酶，ａ一淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶等。 不同生产厂家，饲喂对象不同，复合酶中各种酶的复合比例也不同，但可根 据饲喂对象来选择所使用的复合酶．１．１．４曲霉产酸性蛋白酶制剂研究很多微生物都可生产酸性蛋白酶，其中主要是霉菌如黑曲霉 （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｚ．ｎｉｇｅｒ）、宇佐美曲霉（Ａ．ｕｓａｍｉｉ）、斋藤曲霉（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）、 泡盛酒曲霉（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）和微小毛霉（Ｍ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ）等。但目前用于生产饲用酸性蛋白酶的菌种主要是黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｚ．ｎｉｇｅｒ）和字佐美曲霉（Ａ．ｕｓａｍｉｉ）． １．１．４．１宇佐美曲霉产酸性蛋白酶研究 采用宇佐美曲酶，通过固体或液体发酵法生产酸性蛋白酶，我国在８０年代初已开始进行研究。近年来，随着酸性蛋白酶应用范围的扩大，尤其是作 为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出来的潜在功能越来越引起人们的关注。 宇佐美曲霉用于液体发酵，产酶活性在５ ６００ｕ／ｍｌ左右。国内，于丽萍 等（１９９８）通过控制斜面培养基成分和液体发酵的通气量提高宇佐美曲霉５３７ 产生的酸性蛋白酶活力．产酶活性提高了２０％左右．并用２０Ｌ自控发酵罐发 酵，使产酶活力提高到７ ｌＯＯｕ／ｍｌ。李永泉等（１９９９）以宇佐美曲霉（Ａ．ｕｓａｍｉｉ） 白色突变株Ｂ１为出发菌株，通过微波诱变和亚硝基胍、硫酸锂复合诱变剂点试平板法诱变，选育到一株产酸性蛋白酶的高产菌――栗色变种（Ａｓｐｅｒｇｒｉｌｌｕｓｕｓａｍｉｉｖａｔ．ｍａｒｏｏｎ）Ｌ３３６ Ｈ”，遗传性状非常稳定。微波在生物学上主要用于杀菌、刺激植物生长，微波用于工业微生物遗传育种，国 内至今未见报道。微波诱变正变频率高、效果好、操作简便，所选育菌株遗 传性状稳定。经连续５次传代。酶活力稳定在５４００ｕ／ｍｌ左右””，参照方善 康建立的霉菌麸曲保存法保存２个月后，经摇瓶发酵，酶活力变化不大． １．１．４．２黑曲霉产酸性蛋白酶研究 １９６４年Ｋｏａｚｅ等首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋 白酶，即酸性蛋白酶Ａ和酸性蛋白酶Ｂ，它们主要的区别在于后者的活性中心 含有天冬氨酸残基，而前者则没有。此外，在某些动力学性质上也存在着一 定的差异。 钱玉英等（１９９４）采用黑曲霉ＣＰｕ菌株用”ＣｏＹ射线诱变处理，经初筛、复西南交通大学硕士研究生学位论文第５页筛，获得５株酸性蛋白酶变异菌株。其中６０４２菌株的形态变异株酸性蛋白酶 活力比原始菌株提高近４倍，经多次传代酶活力稳定。用Ｆｏｌｉｎ法测定，酸 性蛋白酶活力高达２３０００ｕ／ｇ。经形态鉴定菌落大小和孢子颜色与原始菌株有 明显差异，其余无特别差异。ＣＰｕ菌株的颜色为黑色，６０４２菌株为浅棕色。 １９９５年，章剑林等采用高温、超剂量常规诱变方法，以黑曲霉菌株的酸性蛋白酶种为出发菌获得的耐高温酸性蛋白酶生产菌Ｓ３―１５菌株，它所生产的耐高温酸性蛋白酶，最适ｐＨ值依次为２．５，３．０，２．０，最适温度为５０℃．同时表明Ｓ３―１５菌株产生的酶分别在不同温度、不同时间下具有较好的耐高温能力。９０℃下恒温４ｈ的酶活性比出发菌株提高６４．２％；６０℃下稀释１００ 倍的酶溶液３０ｍｉｎ酶存活率为７２．８％．所用培养基为黄豆粉、麸皮、硫酸铵 及诱导剂Ａ３。 费笛波、冯观泉等（１９９６）对适合固体培养的黑曲霉变异菌株６０４２进行液 体深层发酵工艺研究，结果显示。其优化工艺为发酵培养基配方：豆饼粉４．５ ％。麸皮０．５％，ＮＨ．ＮＯ。０。５％，ＣａＣｌ２２０。３％，适量产酶诱导物。初始ｐＨ ５．Ｏ～ ５．５，种龄２４ｈ，接种量１０％，发酵温度２８℃，发酵周期７２ｈ。酸性蛋白酶产 酶水平为２４００～２６００ｕ／ｍｌ，纤维素酶８００～９００ｕ／ｍｌ，果胶酶８５０～９５０ｕ／ ｍｌ。该菌株经多次传代，产酶性能稳定。所分泌的这些水解酶可作为饲料添 加剂用酶。该研究经摇瓶培养结果表明，（ＮＨ‘）：Ｓ０。和各种硝基氮均能促进酸 性蛋白酶的生成，其中以ＮＨ。ＮＯ。的效果尤为显著。ＣａＣｌ：对产酶有显著的促进 作用，而ＣａＣＯ。则有抑制作用。ＭｇＳＯ。、Ｋ２ＨＰＯ。、Ｎａ：ＨＰＯ。等对产酶略为有益，但 用量不宜过多。经４批次２３００Ｌ发酵罐扩大试验，发酵单位平均达到：酸性 蛋白酶２５３５ｕ／ｍｌ，纤维素酶８５９ｕ／ｍｌ。 １．１．４．３米曲霉产酸性蛋白酶研究 米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ曲具有丰富的蛋白酶系，能产生酸性、中性和碱性蛋白酶，其稳定性高，能耐受较高的温度，广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中．米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会１９８９年公 布的４０余种安全微生物菌种之一．利用米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）发酵生产蛋白酶是一个典型的固体发酵过程，在酱油酿造中已广泛应用。但有关米曲 霉产酸性蛋白酶的研究到目前为止还很少。 林祖申（２００４）以沪酿３．０４２米曲霉为出发菌株，采用快中子、钴６０ ｙ一 射线、紫外线、甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ），氯化锂等交替诱变育种，筛选出了新 菌株ＵＥ３３６－－２，该菌株生产酸性、中性、碱性蛋白酶能力均高于出发菌株数 倍。新菌株菌丝较长，孢子较少，色泽黄绿鲜艳，并经上海市卫生防疫站鉴西南交通大学硕士研究生学位论文第６页定，未验出黄曲酶毒素Ｂ１．杨世平（２００５）通过对菌株的初筛及培养基组成 和发酵条件的探索，研究了米曲霉产蛋白酶的分布，优化了米曲霉产中性蛋白酶的适宜培养条件以及培养基的最优组成。研究发现米曲霉产中性蛋白酶的能力为最强。米曲霉产中性蛋白酶的适宜培养条件为：四ｎ铁皮，：历（豆粕粉） ＝４：ｌ，水的质量分数为６０％，培养基中各无机盐质量分数为：ＫＮ０３ ０．２％。ＭｇＳｏ． ０．０５％，Ｎａ２ＨＰＯ，０．１３％，ｐＨ值为６．０，接种量为每１０ ｇ培养基接种ｌ－０×ｌｏ＇个 孢子，最佳培养温度为３０℃，最佳培养时间为４８ ｈ。在此培养条件下，最高酶 活力达３９９９．２Ｕ?ｇ－１．由于米曲霉易于培养，且不产生黄曲霉毒素，用于水产养殖水质处理和饲料质量改善将有广阔的前景．１．２新型蛋白饲料蛋白饲料是饲料工业中重要的组成部分，而随着我国畜牧业的迅猛发展， 我国蛋白饲料的产量严重存在供小于需的状况。为了促进我国饲料工业的发 展，开发新型蛋白饲料必然成为未来饲料工业的主体发展目标．目前为止， 具有开发价值的几种新型蛋白饲料主要有饲料酵母、螺旋藻、昆虫类蛋白饲 料、脱酚棉籽蛋白饲料以及发酵后新型蛋白饲料源ｎ”。１．２．１饲料酵母饲料酵母是利用工农业废弃、剩余或廉价的有机化合物为原料，通过在 发酵罐中培养酵母菌所制得的一种工业性蛋白饲料．含粗蛋白４２％～５５％，赖 氨酸６８．６％；维生素Ｂ１、维生素Ｂ２、泛酸等Ｂ族维生素的含量均为鱼粉的５～１０倍。在饲料中添加３％～７％的酵母，育肥猪日增重提高１５％～３０％Ｉ在蛋鸡日粮中添力１１１０％，产蛋量可提高２１％～３５％，每千克酵母可增产３０多枚鸡蛋， 或０．１～Ｏ．５于克禽肉，饲料消耗下降ｌ ０９６～２０９６；饲喂种鸡可提高种蛋的孵化 率，能促进肉用仔鸡的生长，改善肉质口味｛奶牛日粮中添加饲料酵母３冁～ １２％，产乳量可提高３．９％～１５％，乳蛋白质增加７．４５％～１５．６％，并提高牛乳的 乳脂率，可使奶牛的产乳量增加。１．２．２螺旋藻螺旋藻是一种富含天然高蛋白和多种生理活性物质的营养丰富均衡的功 能性藻类，其蛋白质含量高达６０％～７０％，还含有人类和动物所必需的多种 氨基酸及多种有益微量元素。螺旋藻直接投喂或作为添加剂用于饲料中，可 明显促进水产养殖动物的生长发育、增强机体免疫力和提高水产品品质；作西南交通大学硕士研究生学位论文 为开口饵料可显著提高虾、蟹的出池率馏１。第７页螺旋藻富含鱼类必需氨基酸、不饱和脂肪酸、螺旋藻多糖、矿物质、维 生素和一些独特的生物活性物质，并且安全无毒，易于被动物消化吸收，是 目前地球上营养价值最高的物种．螺旋藻蛋白质品质优良，易于消化吸收， 且不含消化吸收障碍因子，其蛋白质消化率大约为７５％，生物学价值为７９．５ ％～８７．７％。螺旋藻还富含蓝藻蛋白（ＦＭＰ）、特殊的拟生长因子和超氧化物 歧化因子（ＳＯＤ）等多种具有重要生理功能的酶。众多试验表明，螺旋藻在水产 养殖特别是育苗中的饲喂效果非常显著，具普遍的促生长、增强抗病力及提 高成活率的效果，可替代部分常规饲料，降低生产成本，取得显著的经济效 益。 螺旋藻蛋白质中富含有各种必需氨基酸，特别是植物饲料缺乏的赖氨酸、 蛋氨酸和色氨酸含量较多。在肉鸡日粮中添加螺旋藻１％～７％，可明显提高日 增重和成活率，且随添加量的增多增重效果越明显，耗料量减少；螺旋藻还 能改善鸡的胴体性状、肉质，使肉质细嫩，吸水力和熟肉率均高于对照组； 在基础日粮中添加２％～４％螺旋藻。可使鸡成活率提高１６．８％，增重提高３３．４ ％：在产蛋鸡饲料中添加０．５％～ｌ％的螺旋藻，产蛋率提高３，５６％～５．２８％， 改善蛋黄颜色，饲料利用率提高９．９％。１．２．３昆虫类蛋白饲料随着我国饲料工业的发展，蛋白质饲料原料的短缺已成为饲料工业发展 的第一限制因子．据中国农业科学院饲料研究所有关专家分析，至，１２０ｌｏ年和 ２０２０年。我国蛋白质饲料的供需缺口分别为０．３８亿ｔ和０．４８亿ｔ。目前，国 内外学者发现，昆虫是最具开发潜力的动物蛋白饲料资源，很多种类的昆虫。如蝇蛆、蝗虫、蚕、蛾，蜂、蚁等都可以作为畜禽的饲料应用。昆虫繁殖快、 数量大、蛋白质含量较高，易于饲养“”州，因此，开发昆虫作为饲料资源，对促进我国畜牧业及饲料工业的发展，具有重要的意义。 大量的营养学研究证明，昆虫体内粗蛋白质含量极高，多在５０％～７０％之间，且含纤维少，微量元素丰富，铜、铁、锌、硒含量较高，氨基酸比较平衡．所含脂类多为软脂肪和不饱和酸，消化性能良好，易于吸收，是优质的蛋白饲 料资源油１．蚕蛹含粗蛋白６８．３％，可消化蛋白质５６．５％。蝇蛆粉蛋白质含量６３％． 每只产蛋鸡每日只需１５～２０克蝇蛆，即可满足蛋白质的需要，可节省饲料和 降低饲料成本。蚯蚓粉含蛋白质６６％，含有多种必需氨基酸，是普通动物蛋白 的２～４倍，在畜禽、鱼饲料中添加５％～７％，可提高增重速度。羽毛粉富含蛋西南交通大学硕士研究生学位论文第８页白质和１０多种氨基酸，还有一种能促进家禽生长的“生长激素”．用羽毛粉 拌料喂鸡、鸭、可使鸡鸭瘦肉增加，脂肪减少，产蛋率提高，并可预防鸡的 食羽癖。白蚂蚁含蛋白质４２％以上，并含多种微量元素，掉入饲料中饲喂畜禽，畜禽生长快，且可提高免疫力．黄粉虫的幼虫、蛹及成虫的蛋白质含量 分别为５１％、５７％和６１％，并含磷、铁、钾等多种矿物质及１６种氨基酸，饲喂畜禽、鱼等效果极佳。 黄自占等（１９８４）报道，在基础日粮相同的条件下，每头猪每天加喂１００ｇ秘鲁鱼粉或蝇蛆粉，结果喂蝇蛆粉的仔猪比喂鱼粉的仔猪增重提高了７．１８％， 而且每天增重０．５ ｋｇ，成本下降１３．２％。用蝇蛆粉喂养的猪瘦肉中蛋白质含 量比喂鱼粉的高３．５％．张建红等（２００２）报道，用蚕蛹粉喂猪，日平均增重比不加蚕蛹粉的要高２３．６％，而且可以缩短育肥期，提高肥猪出栏率。姜利等 （２００２）报道，在猪粗饲料中添加５％～８％蚯蚓粉喂猪，其生长速度可提高１５％。骆世军等（１９９７）报道，猪日粮中添加５％的蚕沙，经济效益比对照组提高７．４％。除此以外，昆虫蛋白质还可以应用于禽类养殖。武满伟等（１９９７）试验证 明，在蛋鸡饲料中用卤虫全部或部分替代进口鱼粉是完全可行的，不仅为养鸡户提供了同样质量的饲料，而且降低了饲料成本，每ｌ ｋｇ蛋的饲料成本降低 ０．１元。刘伯生（１９９４）报道，用３％～６％鲜黄粉虫代替等量鱼粉饲喂肉鸡，增 重速度提高１３．０％，饲料效率提高２３．０％。郭宝忠（２００）报道，在蛋鸡日粮中 加入５％～１０％的蚕蛹粉产量率可提高１８％。杨海明等报道，在粗饲料中添加５％～８％的蚯蚓粉喂养家禽，可使其生长速度提高１５％左右．㈨在水产品养殖方面昆虫蛋白质也发挥了重要作用。祁芳等（２００１）报道，用１６％的柞蚕免疫活性蛋白替代鱼粉饲喂鲍鱼，增长率可提高３１．２％～３２．９％， 并有望缩短鲍鱼的育成时间．用黄粉虫喂养蛤蚧，生长快，个大体肥。产卵率高， 每只蛤蚧每月增重１．７～１．８８ｇ．昆虫是动物界中最大类群，生物量超过其他所有动物（包括人类）生物量 总和的１０倍，属于可更新资源。我国地域广阔，昆虫资源极其丰富，开发饲用 昆虫，可化废为宝，解决我国动物性蛋白质饲料的不足，减少从国外进口鱼粉 量。１．２．４脱酚棉籽蛋白饲料近几年，对饲料的需求越来越大，特别是像豆粕这样的蛋白饲料，一直 处于非常紧缺的状态，５５％左右依靠从国外进口。同时作为产棉大国，我国年 产棉籽约８００万ｔ，提油后的棉粕中含有丰富的蛋白质，其蛋白质含量可达到西南交通大学硕士研究生学位论文第９页３８％～４５％，年产量超过４００万ｔ．占我国各种饼粕年产总量的１２％左右，如果能得到充分利用，将部分缓解我国蛋白原料的供求矛盾。但棉粕中含有棉酚、环丙烯脂肪酸和植酸等抗营养因子，尤其是其中所含的游离棉酚，是具有 活性醛基和羟基的棉酚，毒性较大，是一种细胞性、血管性及神经性毒物，含量 超过安全界限将导致养殖动物生长迟缓、中毒、甚至死亡。哺１ 脱酚棉籽蛋白是采用中棉紫光专利技术“液一液一固植物萃取技术”生 产的一种优质饲用蛋白源，呈金黄色．在加工过程中采用低温一次浸出及２种 溶剂分步萃取等新工艺，并且在所有加工过程中温度都低于８０℃，脱去游离 棉酚的同时，最大限度地保护了蛋白质和氨基酸不受破坏，因此蛋白质的含量 和品质都显著高于经过高温压榨的棉籽饼粕。脱酚棉籽蛋白的粗蛋白含量大 于５０％，氨基酸总量占粗蛋白的９０％以上，游离棉酚含量小于４００ ｍｇ／ｋｇ。 在畜禽饲料中的应用研究表明，其使用效果优于豆粕或与豆粕的效果相当，能 明显提高肉鸡的料肉比、蛋鸡的产蛋率和奶牛的产奶量。脱酚棉籽蛋白中赖 氨酸和蛋氨酸等氨基酸含量均较普通棉粕有很大幅度的提高，其中赖氨酸超 过４０％。蛋＋胱氨酸提高近５０％：与豆粕相比，脱酚棉籽蛋白中除赖氨酸和异亮 氨酸外，其他氨基酸含量均持平或高于豆粕：与蛋白含量高且氨基酸较平衡的鱼粉相比，脱酚棉籽蛋白中精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸含量持平或超过鱼粉水平，但其他氨基酸水平仍然低于鱼粉．因此。在动物饲料中替代鱼粉时应注意 限制性氨基酸的平衡。从饲料应用角度来说，脱酚棉籽蛋白相对豆粕而言，可 消化蛋白提高９％，单位可消化蛋白成本较豆粕低１２．５元（二者均以３ ０００元 ／ｔ计算），具有较高的性价比，面对日益紧张的饲料蛋白原料市场，应用前景 良好。．北京华都肉鸡公司应用棉籽蛋白产品进行了大规模的肉鸡喂养实验。试 验组用棉籽蛋白替代４０％豆粕，对照组用１００％豆粕，试验结果表明，试验组和 对照组在肉鸡成活率和科肉比上均无明显差异。…１１．２．５发酵后新型蛋白饲料源固态发酵有着悠久的历史。广义上讲是指一类使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程，既包括将固态悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没 有（或几乎没有）游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。多数情况 下是指在没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质 中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程汹‘蚓．西南交通大学硕士研究生学位论文 １．２．５．１苹果渣蛋白饲料研究第ｌＯ页我国是世界上苹果生产大国，苹果产量位居世界首位。近年来，苹果汁加工业的迅速发展产生了大量苹果渣。苹果渣含水量高（７０～８２％），且含有丰富的可溶性营养物质，为微生物滋生提供了有利条件，故苹果渣废弃时 极易腐烂发臭，严重污染环境且造成资源浪费曙钉．利用苹果渣发酵生产微生 物蛋白是苹果渣的一种有效利用途径，已有研究表明啸’糟１通过酵母菌和霉菌 混合发酵能提高发酵产物中蛋白质含量，并产生果胶酶等多种酶系，对提高 饲料消化利用率有益。但霉菌和酵母菌发酵剂制备较为麻烦，加上小型企业在设备和技术力量等方面的限制，难以保证发酵剂质量，进而影响发酵饲料 的质量，如能制成含有两种微生物的商品化复合固态发酵剂，则可以简化苹果渣发酵饲料生产工艺，提高产品质量。目前，我国尚无专用于苹果渣发酵 饲料的专用固态复合发酵剂。 贺克勇，杨帆，薛泉宏等人经过研究发现，他们所选用的１０种苹果渣蛋 自饲料固态复合发酵剂均能显著提高苹果渣中蛋白质的含量，但在不同条传 下的发酵效果及产品质量各有不同㈨。司翔宇等利用黑曲霉发酵苹果干渣。经 过单因素试验和工业模拟试验，已经获得了较优的发酵工艺条件，并且研究所用黑曲霉菌种经过试验室长期驯化保存已被用于食品工业，生理活性稳定，安全可靠，用于发酵苹果渣，真蛋白含量由４．７５％提高Ｎ１４．０９％，显著提高了蛋 白质含量，是生产单细胞蛋白的优良菌种。¨” 除此以外，其他果皮及其废渣也可应用固态发酵技术进行微生物处理， 使其转化为富含蛋白质的新型蛋白饲料。如周炼等利用甜橙加工制汁后的废料――甜橙皮渣固态发酵进行新型蛋白饲料研发．通过对发酵饲料样品的相关营养成分分析测定等方式筛选菌种、优化发酵条件，经过单菌试验初步筛选出５株优良菌种，进行３种菌的混合固态发酵，找到了适宜该皮渣发酵的优势 菌种组合，并对发酵条件进行了优化设计，研发出了未添加任何无枫物或有机 氮、全天然、无污染强化蛋白饲料””。 １．２．５．２糖糟与啤酒糟生产蛋白饲料研究… 糖糟是淀粉糖化过滤后得到的副产物．一般糖糟和啤酒糟经干燥、粉碎 后可以直接作为畜禽饲料。糖糟和啤酒糟在未干燥之前含有很多水分，其中 糖糟含有水分约６０％，啤酒糟含有水分约８０％．除水分外，糖糟中含有很高的 残余还原糖，这部分糖可以被酵母利用，转化成菌体蛋白．啤酒糟中含有大 量的粗纤维物质，物理性质疏松，利于酵母生长。利用糖糟和啤酒糟为培养 基，接入酵母进行固态发酵，可以得到蛋白质含量很高的菌体蛋白饲料，从西南交通大学硕士研究生学位论文第１１页而提高糖糟和啤酒糟的附加值．郭建华等人的研究结果表明；在糖糟７０％、啤 酒糟３０％的配比条件下，固态法发酵６０ｈ。发酵温度３０℃，每克发酵基质中可得酵母９５亿个。发酵基质租蛋白从２５％提高Ｎ３６％，得到租蛋白含量很高的优质蛋白饲料。 １．２．５．３食物垃圾生产微生物蛋白饲料食物垃圾主要是指食品工业废弃物，家庭及饮食业在清洗、烹饪过程中扔掉的食物，吃剩的残渣剩菜和因保管不善而变质的食物。这类垃圾数量很 大，在生活垃圾中占有很大比例，大城市及发达的中等城市的食物垃圾在生 活垃圾中的比例一般超过５０％，有的城市甚至超过７０％…１． 而一般情况下，食物垃圾被养猪户拉走直接饲喂牲畜的现象屡见不鲜。但是，若是用食物垃圾直接喂养生猪，极有可能造成人畜之间疫病的交叉传染。同时食物垃圾也是“泔水油”的源头，直接危害着人们的身体健康． 近年来，利用农副产品下脚料及食品加工业的废渣废液，通过微生物发 酵生产单细胞蛋白饲科，取得了一系列的研究成果。而目前利用食物垃圾生产蛋白饲料的研究主要集中在利用垃圾废液进行液态发酵培养高蛋白微生物 的研究上，但也有人开始利用食物垃圾进行固态发酵生产蛋白饲料的研究， 而且这一技术必然会成为今后食物垃圾处理技术的重要研究方向啪“１。利用食物垃圾开发新的廉价微生物蛋白饲料，既可解决当前世界蛋白饲料严重短 缺的问题，又可使食物垃圾减量化、无害化。虽然目前利用食物垃圾生产微 生物蛋白饲料的研究相对较少，未形成成熟的技术工艺，但该思路是一种值 得探索的垃圾处理方法，必将具有很好的发展前景。 １．２．５．４马铃薯薯渣蛋白饲料研究 我国有丰富的马铃薯资源。据统计，我国马铃薯种植面积为４０万ｈｍ２以上， 年总产量为５５０万ｔ左右，仅次于俄罗斯，居世界第二位。但马铃薯的深加工用于制淀粉和粉条，产生大量的废渣，而无法充分利用㈣。马铃薯渣的主要成份是淀粉、纤维素，半纤维素及蛋白质。马铃薯渣作为动物饲料，适口性差， 不易被动物接受。而采用淀粉酶和蛋白酶水解法制备具有保健，抗癌作用的 马铃薯渣膳食纤维，则可以变废为宝，并且同时会产生富含淀粉水解物和蛋白 质水解物的水解液．因此通过微生物发酵技术，以马铃薯渣生产单细胞蛋白 质饲料，可以变废为宝，开辟饲料新资源，避免废渣对环境污染。而单细胞 蛋白质不仅营养丰富、蛋白质含量较高，而且它的生产具有繁育速度快、生 产效率高、占地面积小、不受气候影响等优点Ⅲ１．因此，在当今世界蛋白质 资源严重不足的情况下，利用马铃薯渣发展单细胞蛋白的生产不仅可以避免西南交通大学硕士研究生学位论文第１２页淀粉生产企业对周围环境的污染，而且还具有良好的经济效益和社会效益， 为缓解当今我国饲料蛋白的不足做出突出贡献，极大的促进我国畜牧业的快 速发展。 王文侠、吴耘红等利用马铃薯废渣，将制各马铃薯膳食纤维得到的水解液， 采用微生物发酵法制成优质单细胞蛋白饲料的研究结果表明啊１；单细胞蛋白 中的蛋白质含量高达１２．Ｚ７％，产物得率则为３９．３９％。 赵风敏等则以马铃薯淀粉生产中产生的废渣为主要原料，利用筛选出的 糖化菌种和高蛋白菌种组成的双菌发酵体系，对马铃薯薯渣固态发酵生产蛋 白饲料的发酵工艺进行了研究ｍ１，确定了发酵培养基的最佳组成与配比． １．２．５．５秸秆生物蛋白饲料 秸秆生物蛋白饲料就是以农作物秸秆、树叶，杂草等作为主要原料，将原 料置于人工制造的特定的生态环境中，经生化饲料发酵剂进行微生物发酵处 理，促进微生物的大量繁殖和活动。利用原料的营养物质合成游离氨基酸和 菌体蛋自，从而使秸秆转化为富含租蛋白、脂肪、氨基酸及多种维生素等的 高效能生物蛋白饲料¨”。 以农作物秸秆为原材料，经微生物发酵生产生物蛋白饲料，不仅提高了农 作物秸秆的消化率，也提高了畜禽对蛋白质的利用率。生成的氨基酸提高了饲 料的适口性及营养力，发酵过程中产生的各种有用的代谢产物，如抗生素、维生素、有机酸、激素等。这些有益于增强动物抗病力，促进新陈代谢，促进有益 菌群生长繁殖，抑制致病菌的生长．由于发酵秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素的降解，转变秸秆中的不溶性碳水化合物为可溶性碳水化合物，从而拓宽 了秸秆的饲用范围，不仅适用于反刍动物，也适用于猪、鸡等单胃动物。可是， 目前微生物转化秸秆生产蛋白质强化饲料的研究虽取得了一些进展，但大多 数尚处于实验室研究阶段，离实际应用和产业化尚有一段距离Ｈ””３． 据河南科技学院动物科学系崔艳红报道，他们采用多株真菌混合发酵秸 秆生产蛋白强化饲料的研究表明：在多菌种混合发酵中，粗纤维降解率并没有 大的提高，这可能由于试验中代谢产物对酶合成的阻遏和反馈抑制及真菌间 对碳源的竞争作用抑制了木质纤维素的利用Ⅲ１。因此未来应进一步对接种量、 菌种比例、接种时间、外源无机氮源、培养温度等发酵条件对混合发酵的影 响作研究，探讨微生物之间的协同拮抗关系，加强蛋白饲料生产配套工艺的研 究．西南交通大学硕士研究生学位论文第１３页１．２．６胶原蛋白饲料胶原是脊椎动物或无脊椎动物支持结构的主要组成部分，存在于动物的皮、骨、软骨、肌腱、韧带、血管及结缔组织内，是最主要的蛋白质“”。胶 原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的２５％～３０％”１．胶原蛋白粉是利用皮革厂的副产品原皮下脚料经过特定的加工工艺处理 后所得的一种新产品。饲料胶原蛋白粉含粗蛋白５０％以上“”，为米黄色粉末， 带有芳香味，不易吸潮。’猪的粗蛋白消化吸收率经广东省农科院畜牧研究所测定，干物质、粗蛋 白和粗灰分的消化吸收率分别为７６．６％，８４．６％和４９．８％；消化能１３．１８０ＭＪ?ｋｇ～。 饲喂鸡，其代谢能值为１２．８１ １ＵＪ?ｋｇ一。饲料胶原蛋白粉适口性好、营养价值高，有一种清香味，畜禽喜食。并 且其粗蛋白的体外消化率达９１．７％。高于进口鱼粉和其他动物性蛋白。在配合饲料中代替大部分进口鱼粉，适当补充赖氨酸和蛋氨酸，饲喂效果和综合经 济效益都超过全鱼粉配方的水平。加入饲料胶原蛋白动物的抗病能力也会相 应增强，可使鸡的死亡率从２０％以上降低到３％以下，是其他任何一种饲料添加 剂（除药物以外）所不能比拟的６“删。饲料胶原蛋白还具有一定的黏结性， 可显著提高颗粒饲料的外观质量，尤其是提高了水产饵料在水中的稳定性””５ａ］●因此在目前国内外鱼粉蛋白质饲料紧缺以及环保问题倍受重视的情况下，大力推广开发饲料胶原蛋白粉资源将大有前途．１．３小肽饲料营养小肽是蛋白质降解为氨基酸过程中的中间产物，是动物蛋白质营养中的 重要物质。一般是由两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，如二肽 或着三肽。 传统的蛋白质消化、吸收理论认为，蛋白质在肠道内，在胰蛋白酶和糜蛋白酶作用下生成游离氨基酸和小肽，小肽在肽酶的作用下被完全水解成游离氨基酸，并以游离氨基酸形式进入血液循环，即动物对蛋白质的需要就是对氨基酸的需要，给动物提供充足的必需氨基酸，动物就能获得满意的生产性能。但在１９２１年Ｂｏｅｇｌａｎｄ提出了小肽转运的可能性，可人们受传统蛋白质 消化吸收理论的影响。对小肽完整吸收的观点难以接受．直Ｎ２０世纪６０年 代以后，许多学者做了大量的试验发现，用纯合日粮或低蛋白氨基酸平衡的西南交通大学硕士研究生学位论文第１４页日粮饲喂动物并不能达到最佳生产性能…１．Ｎｅｗｅｙ和Ｓｍｉｔｈ（１９６０）又提出了 令人信服的小肽可被完整吸收的论据，证实了完整的甘氨酰一甘氨酸能被转 运吸收饰５３。Ｈａｒａ等（１９８４）也指出，蛋白质在消化道中的消化终产物的大部分 是小肽，且小肽能完整地通过肠粘膜细胞而进入体循环呻’。小肽的Ｉ型载体 （Ｆｅｉ。１９９４）和ＩＩ型载体（Ａｄｉｂｉ．１９９６）分别被克隆。这样小肽能被完整吸收 的观点逐渐被人们认识和利用。１．３．１小肽的吸收优势小肽的吸收与游离氨基酸的吸收（ＦＡＡ）比较，具有更多的优越性，小肽的吸收具有速度快、耗能低、载体不易饱和的特点，可以消除以游离氨基酸形式吸收时氨基酸之间的相互竞争。加速蛋白质的合成。Ｒｅｒａｔ等（１９８８） 报道。向猪十二指肠内分别灌注小肽和游离氨基酸混合物后，除蛋氨酸外。出现在门静脉中的小肽比灌注相应游离氨基酸快，而且吸收峰高。动物肠粘膜上存在肽的转运载体㈣，而且一些动物的载体基因已被克隆表达。Ｄａｎｅｉｌ 等（１９９４）汹１认为，小肽载体的吸收能力可能高于各种氨基酸载体吸收能力的 总和，小肽中氨基酸残基被迅速吸收的原因，除了小肽吸收机制本身外，可 能是小肽本身对氨基酸或氨基酸残基的吸收有促进作用。Ｂａｍｂａ（１９９３）指出， 作为肠腔的吸收底物，小肽不仅能增加刷状缘氨肽酶和二肽酶的活性，而且还能提高小肽载体的数量。小肽的吸收不仅比ＦＡＡ快，而且还有吸收率高、 吸收强度大的优势。一些小肽可完整地进入血液循环，血液循环中的小肽量则会受到日粮中小肽的影响旧１。小肽的作用是氨基酸所不能替代的，因为某 些肽的生理活性与其特定的结构有关，它们在消化过程中发挥着重要的生理 作用㈣。１．３．２小肽的营养作用１．３．２．１促进氮基酸的吸收，提高蛋白质的沉积率小肽与游离氨基酸具有相互独立的吸收机制，二者互不干扰，这就有助于 减轻由于游离氨基酸相互竞争共同吸收位点而产生的拮抗作用，从而促进氨 基酸的吸收，加快蛋白质的合成。 施用晖等“”（１９９６）在研究不同比例小肽与ＦＡＡ吸收影响时发现，当完 全以小肽的形式供给动物时，赖氨酸的吸收速度不再受精氨酸的影响。小肽 吸收本身不易饱和，转运速度快，能缓解肠壁细胞对不同ＦＡＡ摄入的竞争， 故小肽的氨基酸能够迅速吸收。Ｂａｍｂａ等（１９９２）报道，小肽作为肠腔的吸收。西南交通大学硕士研究生学位论文第１５页底物，不仅增加刷状缘膜的氨基酸肽酶活性，而且提高二肽酶和氮基酸载体 的活性和载体数目。Ｋａｒａ等（１９９３）研究表明，饲喂酪蛋白日粮的大鼠。小 肠对寡聚蛋氮酸的吸收速度高于大豆蛋白日粮。而且日粮蛋白质中的小肽可影响鱼类消化吸收和血液循环中小肽种类和含量，从而促进机体对氨基酸的吸收和利用…． １．３．２．２提高蛋白质的合成效率 小肽能以完整形式被机体吸收进入循环系统，从而被组织利用来合成蛋 白质或直接成为生理活性物质。小肽不仅能被小肠粘膜吸收利用，而且其合 成分子蛋白的速度远远高于氨基酸。大量试验证明，血液循环中的小肽能直 接参与组织蛋白质的合成ｍ，。小肽吸收避免了游离氨基酸在吸收时的竞争， 合成蛋白质的效率也随之升高。乐国伟（１９９６）观察到雏鸡在灌注酪蛋白水解 物小肽时。组织蛋白质合成率显著高于相应游离氨基酸混合组。Ａｄｉｈｉ等 （１９７７）通过向小鼠静脉灌注双甘肽和甘氨基酸一卜亮氨酸发现，这些肽在 血浆中消失的很快，但尿液中都没有发现其存在。同时发现某些组织中与肽 水解有关的酶活性很高。而在血浆中这些酶几乎没有活性，表明这些肽很可 能是在组织中分解而不是在血浆中分解。此外，动物以小肽形式作为氮源时， 整体蛋白质沉积高于相应的游离氨基酸日粮或完整蛋白质日粮旧１． １．３．２．３提高矿物元素的吸收利用率 Ｍａｒｉａ等（１９９５）报道，肉类水解物中的小肽能使亚铁离子可溶性、吸收率提高。张滨丽（２０００）报道，酪蛋白磷酸肽（ＣＰＰ）在动物小肠内能与钙结合而阻止磷酸钙沉淀的形成，使肠道内溶解性钙量大大增加，从而促进了钙的吸收和利用。李永富等（２０００）报道，对１～２１日龄的乳猪分别添加小肽铁、右旋糖苷铁，１４日龄时测血清铁蛋白含量，其中添加小肽铁组明显高于添加右旋 糖苷铁组和对照组，这说明以小肽络合物形式存在的矿物离子更易被机体吸 收。 １．３．２．４提高动物生产性能 多种生物活性小肽（磷酸肽、阿片肽、内啡肽、促泌肽等）可在消化过程 中释放出来，促进消化道的蠕动，改善消化机能，促进动物生长””． Ｐａｒｉｓｉｎｉ等（１９８９）在生猪日粮中添加少量的小肽制品后，提高了猪的 日增重、蛋白质利用率和饲料转化率，其原因可能是与肽链的结构功能有关 呻’。施用晖（１９９６）报道。在蛋鸡基础日粮中添加小肽制品后，蛋鸡的产蛋 率、日产蛋量和饲料转化率均显著提高，蛋壳强度有提高的倾向㈣．Ｆａｎｔｅ （１９９２）试验表明，饲喂富含小肽的蛋白质水解物日粮能使蛋白质营养不良西南交通大学硕士研究生学位论文第１６页的大鼠体重快速恢复，而饲喂游离氨基酸组恢复较慢。大量试验表明，在日 粮中添加小肽对动物的生产性能有明显的促进作用。ＺａｍｂｏｎｉｎｏＩｎｆａｎｔｅ等（１９９７）报道，用小肽代替海舻鱼日粮中的部分蛋白质后。鱼苗的生长速度和存活率提高；胰凝乳酶和Ｙ一谷氨酰胺转氨酶的活 性提高，氨肽酶的活性降低，小肠消化功能提高。在虾苗中添加小肽，能促进采 食，增加生长速度及苗体的长度。再则，某些具有特殊生理活性的小肽还能够 参与机体生理活动和代谢调节，也可能是小肽提高动物生产性能的原因。 １．３．２．５提高动物体的免疫作用Ｓａｍｏｒｏ等（１９８８）发现，人乳和牛乳受酪蛋白酶作用后可释放免疫调节肽。在体外试验中有明显促进人、动物体内的吞噬作用，增加淋巴细胞转移 与淋巴因子释放的功能。高萍等（２０００）研究表明，注射一定剂量的猪胰多肽， 可提高仔猪的血清球蛋白水平，增强仔猪免疫力。Ｈｙｏｗｎ、Ｊｏｒｅ等已从牛乳 中分离出可抑制肿瘤细胞生长的小肽…１． １。３。２。８促进瘤胃微生物对营养物质的利用 饲料蛋白质进入瘤胃后，大部分迅速分解成肽以后被微生物利用。Ａｒｇｇｄｅ （１９８９）发现。瘤胃微生物蛋白合成所需的氮，大约有２／３来源于肽和氨基酸， 肽是瘤胃微生物合成蛋白质的重要底物。Ｃｒｕｚ Ｓｏｔｏ等（１９９４）报道，以可溶性 糖作为能源时，小肽促进可溶性糖分解菌的生长速度比氨基酸的促进作用高 ７０％。Ｃｈｅｎ等（１９８７）发现奶牛瘤胃液内肽不足是限制瘤胃微生物生长的主 要因素。另一些研究者发现肽是瘤胃微生物达到最大生长效率的关键因子。 而瘤胃微生物又在反刍动物营养中发挥着重要的作用。这也就间接的影响了。反刍动物饲养中的营养吸收。１．３．２．７其他 小肽还能阻碍脂肪的吸收，并能促进“脂质代谢”，因此，在保证摄入足够 量的肽的基础上，可将饲料其他能量组分减至最低。另外，体内小肽可促进葡萄糖的转运且不增加肠组织的氧消耗油１。Ｃｕｂｅｒ（１９８９、１９９０）还发现，酪蛋白水解的某些肽能促进大鼠ＣＣＫ的分泌。Ａｚｕｍａ（１９８９）则发现鸡蛋蛋白中提 取的某些肽能促进细胞的生长和ＤＮＡ的合成””．１．３．３小肽饲料相关产品目前市场上出现的小肽制品有：快大快一一它是采用分阶段酶解工艺从深海鱼中提取得到的各种小肽的超浓缩物经低温干燥制得的；肠膜蛋白粉 （ＤＰＳ）一一主要成分是猪肠粘膜的水解蛋白质，含有部分小肠促生长肽：喂大西南交通大学硕士研究生学位论文 等。第１７页快一一是海鱼蛋白水解产物，含有一定量的生物活性肽、有机螫合微量元素１．４选题依据及本研究的主要内容小肽吸收理论极大地丰富了蛋白质营养理论。小肽的各项营养学优势也 证明了小肽制剂的添加在动物营养吸收中具有十分重要的作用。因此小肽制品的开发已成为当前饲料添加剂行业中一个新的亮点和主要发展方向。研制开发新型小肽类饲料制品，并将其应用于畜牧业必将有着巨大的经济潜力和 广阔的发展前景。 面对当的蛋白饲料资源的极度紧缺，作为一种新型的饲料添加剂，蛋白 酶可在适宜的条件下水解饲料中的动物和植物类蛋白质，成为小肽以及游离 的氨基酸，提高动物对蛋白质的利用效率，促进动物对饲料蛋白质的吸收。进而促进动物（尤其幼年动物）生长发育。因此饲料中添加蛋白酶越来越受 到饲料营养界的关注，新型蛋白酶饲料的研发也越来越受到畜牧业研究机构的重视。但传统蛋白酶类饲料和小肽类饲料的制作工艺，基本均采用直接加 入工业化生产出的各种饲料级蛋白酶，由于蛋白酶在动物体内可能被动物体 内自身蛋白酶所分解，导致外源性蛋白酶效率降低。特别是目前生产小肽类 饲料添加剂的生产成本很高，限制了小肽类新型饲料添加剂在畜牧业中广泛 的应用。因此，寻求一种更好的酸性蛋白酶和小肽类饲料添加剂生产方法成 为了研究者最感兴趣的问题之一． 而采用米曲霉和酵母菌直接混合固态发酵的方法进行酸性蛋白酶类饲料 生产，产品中不但含有大量的酸性蛋白酶和单细胞饲料酵母蛋白，而且还利 用混合固态发酵所产的酸性蛋白酶以及发酵开始时在培养基中的大量高活性米曲霉曲子，对培养基中的蛋白源进行部分转化，使其含有丰富的小肽类制剂。该法不仅清洁环保、成本较低，而且不涉及酸性蛋白酶的租提取，下游 处理过程简单方便，产品经济价值较高。因此，混合固态发酵法生产富含小 肽类蛋白饲料的思路，在新型小肽营养饲料研发中必将大有应用发展前景． 本文将以麸皮和豆饼粉为主要原料，以米曲霉菌Ａ－２９和酵母菌ＣＨＣ－３、ＤＳＦ－Ｉ、ＧＹ－Ｉ为出发菌株，通过培养基的优化和混合固态发酵工艺的研究，获 得一条富含小肽的新型蛋白饲料生产工艺。该工艺不仅清洁环保、节约能源，而且成本较低、物美价廉，易于在畜牧业中推广应用。本文还将对经该工艺 生产出的新型蛋白饲料进行仔猪饲喂试验，以验证其营养效果．最后。将会西南交通大学硕士研究生学位论文第１８页对酸性蛋白酶进行分离纯化，以阐明其相关酶学特征。本课题的主要研究内 容包括：ｉ）产酸性蛋白酶的米曲霉菌的筛选，以及培养条件、，固态纯种发酵产酸性蛋白酶工艺的优化．２）以米曲霉为主，多种酵母为辅的新型蛋白饲料固态混合发酵工艺研究。 ３）富含小肽制剂的新型蛋白饲料仔猪饲喂试验。 ４）酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性研究．西南交通大学硕士研究生学位论文第１９页第２章酸性蛋白酶固态发酵工艺研究酸性蛋白酶（Ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）是一种适合在酸性条件下水解蛋白质的酶 类。最早发现于２０世纪初，一般包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶． 微生物所产的酸性蛋白酶是研究和应用最为普遍的一种，已广泛应用于食品、酿造、毛皮与皮革、胶原纤维、饲料工业等诸多行业之中。目前发现，很多微生物都可以生产酸性蛋白酶，其中主要是霉菌如黑曲霉 （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｚ．ｎｉｇｅｒ）、宇佐美曲霉（Ａ．ｕｓａｍｉｉ）、斋藤曲霉（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）、泡 盛酒曲霉（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）和微小毛霉（Ｍ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ）等。但目前用于生产饲用酸性蛋白酶的菌种主要是黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｚ．ｎｉｇｅｒ）和宇佐美曲霉（Ａ。ｕｓａｍｉｉ）。黑曲霉主要用于固体发酵，而宇佐美曲霉主要用于液体发酵。 本研究以本实验室保藏的米曲霉为研究对象，进行菌种筛选、培养基优化以及固态发酵工艺研究，以获褥较佳的酸性蛋白酶发酵生产工艺。２．１材料及仪器２．１．１材料和试齐０２．１．１．１培养基 １．麦芽汁斜面培养基：取已制备好的麦芽汁，调糖度为８％，加２％琼脂， ｐＨ自然，融化后分装试管，１２１℃，高压蒸气灭菌２０ｒａｉｎ，制成斜面培养基。 ２．优化出的酸性蛋白酶最佳正交培养基：豆饼粉７．５％，（Ｎ也）：ＳＯ。０．８％， ＫＨ：ＰＯｌＯ．２５％，水４０％，麸皮５１．４５％．’２．１．１．２菌种 米曲霉Ａ－－２９（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ ｏｒｙｚａｅＡ－２９）；米曲霉Ａ－－７９（ａｓｐｅｒｇｌｌｌｕｓＡ－７９）以上菌株为本实验室保存菌株，保存菌株的培养基为麦芽汁斜面培养基。 ２．１．Ｉ．３试剂’磷酸二氢钾（汕头市光华化学厂，分析纯） 硫酸铵（汕头市光华化学厂，分析纯） 钨酸钠（汕头市光华化学厂，分析纯） 浓溴水（天津市大茂化学试剂厂，分析纯） 碳酸钠（汕头市光华化学厂，分析纯）西南交通大学硕士研究生学位论文 三氯乙酸（广州医药站化学试剂综合公司，分析纯） 进口干酪素（广州医药站化学试剂综合公司，分析纯） 浓盐酸（成都新都海兴试剂厂，分析纯） 氡氧化钠（天津市化学试剂三厂。分析纯） 乳酸（成都金山化工试剂厂） 乳酸钠（天津市化学试剂六厂三分厂，分析纯） 硫酸锂（ｈｇ都科龙化工试剂厂） 麸皮、豆饼粉（成都本地市场购买）第２０页２．１．２试剂的配制２．１．２．１福林试剂的制备 于２０００ｍｌ磨口回流装置加入钨酸钠ｌＯＯｇ，钼酸钠２５９，水７００ｍｌ、８５％ 磷酸５０ｍｌ、小火沸腾回流ｌＯｈ，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂５０９、 水５０ｍｌ和数滴浓溴水（９９％），再微沸１５ｍｉｎ，以除去多余的溴（冷却后仍有 绿色需加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加蒸馏水定容至１０００ｍｌ，混匀， 过滤，制得的试剂应呈黄色，贮存在棕色瓶内。２．１，２．２．０．４ｍｏＩ／Ｌ碳酸钠溶液 ０．４ｍｏｌ／Ｌ三氯乙酸溶液称取无水碳酸钠４２．４９，用蒸馏水溶解并定容至１０００ｍｌ２．１．２．３称取６５．４９三氯乙酸，用蒸馏水溶解并定容至１０００ｍｌ２．１．２．４１０９／Ｌ酪素溶液称取１．０００９，精确至０．００１９。再用２～３滴浓乳酸湿润后，加入适量的 各种适宜ｐＨ的缓冲液约８０ｍｌ，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷 却后，转入ｌＯＯｍｌ容量瓶中，用适宜的ｐＨ缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱 内储存。有效期为三天。２．１．２．５ １００ｐ ｇ／ｍｌＬ＿酪氨酸标准溶液ａ．称取预先于１０５＂Ｃ干燥至恒重的Ｌ一酪氨酸０．１０００９，精确至０．０００２９。 用ｌｍｏｌ／Ｌ盐酸６０ｍｌ溶解后定容至ｌＯＯｍｌ，即为ｌｍｇ／ｍｌ酪氨酸标准溶液 ｂ。吸取ｌｍｇ／ｍ１酪氨酸标准溶液１０．ＯＯｍｌ，用０．１ｍｏｌ／１盐酸定容至ｌＯＯｍｌ， 即得１００ｕ ｇ／ｍｌ Ｌ－酪氨酸 ２．１．２．６缓冲溶液的配制：（乳酸缓冲液）ｐＨ＝３．０ 甲液：称取乳酸（８０～９０％）１０．６９，加水溶解并定容至１０００ｍｌ。 乙液：称取乳酸钠（７０％）１６９，加水溶解定容至１０００ｍＩ。西南交通大学硕士研究生学位论文第２１页使用溶液：取甲液８ｍｌ，加乙液Ｉｍｌ，混均，稀释一倍，即成０．０５ｍｏｌ／ｌ 乳酸缓冲液。２．１．３仪器电热恒温培养箱（ＤＮＰ－９５０２。上海精宏实验设备有限公司）电热恒温鼓风干燥箱（Ｉ）ＮＰ一９５０２，上海精宏实验设备有限公司） 可见分光光度计：（７２２Ｎ可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司）手提式不锈钢蒸汽消毒器（上海三中医疗器械有限公司）水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司 超净无菌工作台：苏净集团安泰公司２．２实验方法２．２．１２．２．１．１Ｌ－酪氨酸标准曲线的绘制Ｌ－酪氨酸标准待测溶液的配制用１００ｕ ｇ／ｍ１ Ｌ一酪氨酸，按表２－Ｉ配制待测溶液，定容至２５ｍｉ。表２－１Ｌ一酪氨酸标准待测溶液的配制ｌ ２ ３ ４． ５ ６０ ２．５ ５ ７．５ ＩＯ １２．５２５ ２２．５ ２０ １７。５ １５ １２．５０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０２．２．１．２Ｌ－酪氨酸标准待测溶液光吸收值ｋｏ的测定１．分别取上述溶液Ｉｍｌ，各加０．４ｍｏｌ／ｌ的Ｎａ：Ｃ０。溶液５．ＯＯｍｌ，福林试剂 １．ＯＯｍｌ，置于４０±０．２℃的水浴中显色２０ｒａｉｎ． ２．取出试液用分光光度计于６８０ｎｍ，ｌＯｎｍ比色皿，以不含Ｌ一酪氨酸标准西南交通大学硕士研究生学位论文 溶液为空白，分别测光吸收值Ａｍ。实验结果见表２―２第２２页表２―２Ｌ－酪氮酸标准溶液的光吸收值３．以光吸收值Ａ。为纵坐标，以Ｌ一酪氨酸为横坐标绘制标准曲线。此线要 通过零点。根据作图或用回归方程计算出光吸收值Ａｍ为Ｓ时Ｌ一酪氨酸的量（ｐ ｇ），即为吸光常数Ｋ．如图２－－ｌ，６０：５０ 皇 ＼：４０篓３０锱 撅２０盔上１００ Ｏ ０．１ ０。２ ０．３ ０．４ ０．５ ０．６吸光度Ａｂｓ 图２－－１ Ｌ一酪氨酸标准曲线 说明：由图中可以看出，直线Ｙ＝１００．５２ｘ一０．０８１，其斜率ｋ＝－１００．５２， 即吸光常数Ｋ＝１００．５２，Ｒ２＝０．９９９８西南交通大学硕士研究生学位论文第２３页２．２．２发酵方法２．２。２。１菌株的转接 将本实验室保藏的两株米曲霉菌株Ａ－２９、Ａ＿７９分男町在无菌操作条件下使 用接种环接入斜面培养基中，并置于恒温培养箱中２９℃培养９６ｈ，使之全部 孢子化后取出备用。 ２．２．２．１固态发酵培养在５００ｍｌ三角瓶中装入固态发酵培养基，玻璃棒搅匀后，１２１℃下灭菌２０ｍｉｎ，冷却后在超净工作台上将转种后的菌株孢予接入装有固态培养基的三角瓶中，每个培养基接２～３环孢子，混均。然后置于恒温培养箱中２９℃培养７２ｈ．２．２．３分析方法２．２．３．１酶的提取称取发酵后的培养物２．Ｏｇ，用８０ｍｌ缓冲液在研钵中捣碎充分溶解，然后将混合液经滤纸过滤，取滤液５ｍｌ加蒸馏水定容至ｌＯＯｍｌ，即得稀释８００倍的 待测酶液。 ２．２．３．２酸性蛋白酶酶活的测定ｍ３ ａ．先将酪素液放入４０±Ｏ．２＂Ｃ恒温水浴中预热５ｍｉｎ ｂ．测定： 在试样管中，取经４０±０．２℃预热２ｍｉｎ的稀释酶液１．Ｏｍｌ，加入预热的 ｌＯｇ／Ｌ酪素溶液１．Ｏｍｌ，于４０±０．２＂Ｃ保温ｌＯｍｉｎ，立即加入０．４ｍｏｌ／Ｌ的三氯 乙酸溶液２．Ｏｍｌ以终止反应．在空白对照管中，取经４０±０．２＂Ｃ预热２ｍｉｎ的稀释酶液１．Ｏｍｌ，先加入０．４ｍｏｌ／Ｌ的三氯乙酸溶液２．Ｏｍｌ，于４０±０．２℃保温ｌＯｍｉｎ，再加入预热的ｌＯｇ／Ｌ酪素溶液１．Ｏｍｌ。将上述的试样管和空白对照管 取出静止ｌＯｍｉｎ后过滤，取１．Ｏｒａｌ滤液，加入０．４ｍｏｌ／ｋ碳酸钠溶液５．Ｏｍｌ， 再加福林试剂１．Ｏｍｌ，４０±０．２＂Ｃ水浴中显色２０ｍｉｎ取出，冷却后在６８０ｎｍ处 测定吸光度。 ２．２．３．３酸性蛋白酶酶活的计算 酸性蛋白酶酶活的定义：１９固体发酵产物，在乳酸缓冲液中，于４０℃的 条件下，一分钟分解酪蛋白产生一微克的酪氨酸称为一个酶活单位，以Ｕ／ｇ 表示。?计算公式为：Ｘ＝Ａ×ＫＸｖ／ｔＸｎ＝２／５ＸＡ×ＫＸｎ西南交通大学硕士研究生学位论文 Ｘ：样品酶活力 Ｋ：吸光常数 ｔ：反应时间（本实验ｔ－－－－１０）第２４页Ａ：样品平行实验平均吸光度 Ｖ：反应体积（本实验ｖ＝４） ｎ：稀释倍数注：平行误差不超过３％，并且本实验中如果无特别说明，菌体的重量都是指发酵后菌体的湿重。２．２．４培养基优化方法通过查阅相关文献，确定菌种培养的初始培养基。再在此基础上进一步 筛选出较适培养基后进行正交试验，优化确定米曲霉产酸性蛋白酶的最佳培养基。２．３结果与讨论２，３．１初始培养基的筛选通过查阅有关酸性蛋白酶固态发酵资料发现，麸皮、豆饼粉以及微量的 无机盐是米曲霉产酸性蛋白酶培养基所必需的，因此本实验首先选择下列３个配方，进行固态发酵培养，以考查Ａ－－７９和Ａ一２９米曲霉菌株的生长性能以及产酸性蛋白酶能力。①麸皮４８％，豆饼粉４９．９％，磷酸二氢钾Ｏ．１０％，硫酸铵２％，固体：水＝１０：９②麸皮７３％，豆饼粉２４．７％，磷酸二氢钾０．３０％，硫酸铵２％，固体：水＝ｉ０：９⑨麸皮７８％，豆饼粉１９．８％。磷酸二氢钾０．２０％，硫酸铵２％，水＝ｉ０：９固体：研究结果表明，Ａ一７９和Ａ一２９菌株在①号培养基上生长缓慢，且菌株的 孢子化程度不高，产酶水平较低（４５６２．１５ｕ／ｇ和８４５２．４５ｕ／ｇ）；②号培养基 菌株生长情况与①号相似但菌株总量较大，酶活水平提高不大；③号培养基的菌株生长良好，菌株孢子化程度较好，酶活水平分别达到了６１３７，４６ｕ／ｇ和１０４６３．４６ｕ／ｇ。因此以⑨号培养基为基础，设计正交实验。２．３．２酸性蛋白酶生产菌株的筛选米曲霉Ａ一７９和Ａ一２９虽均为本实验室保藏的酸性蛋白酶生产菌株，但它们的生产酸性蛋白酶的能力却有着较大的差别。因此我们需要通过③号培西南交通大学硕士研究生学位论文第２５页养基上菌株产酸性蛋白酶活力比较。从两株菌株中筛选一株生产性能较好的 菌株。以此菌株作为本实验下一步工艺研究的出发菌株。分别将２抹待选菌株接种到③号培养基中，每瓶２环，在恒温培养箱中２９℃下培养７２ｈ，测定产物中酸性蛋白酶活性。结果发现，米曲霉Ａ一２９菌株 产酸性蛋白酶能力平均达到１２４５３．５８ｕ／ｇ，远远高于Ａ一７９的８１５２．８５ｕ／ｇ，故选取米曲霉Ａ一２９菌株作为进一步工艺研究实验菌株。２．３．３米曲霉Ａ一２９固态发酵培养基优化在基础培养基（③号培养基）中，选取豆饼粉（Ａ）、水（Ｄ）、（ＮＨ．）书仉（Ｂ）、ＫＨ：ＰＯ，（Ｃ）等４个因素。按表２―３所示的因素水平进行正交实验，实‘验设计及结果如下．表２―３培养基配比正交实验设计与结果／％西南交通大学硕士研究生学位论文第２６页由表２－－３可见，当实验组合为Ａ２Ｂ：Ｃ。Ｄ，时，酸性蛋白酶酶活有最大值１７２７３．３６ｕ／ｇ，而组合Ａ，吼Ｃ．Ｄａ。酸性蛋白酶酶活出现最小值１２４１６．２３ ｕ／ｇ。而除实验组合矗。Ｂ，Ｃ癜酸性蛋白酶活力达到１４５７１．３８ ｕ／ｇ外，其他实验组合 所产酸性蛋白酶酶活均几乎在１３０００～１４０００ｕ／ｇ之间。表２―４为培养基各成 分对米曲霉产酸性蛋白酶能力的极差分析表。表２－４米曲霉培养基各因素极差分析表／ｕ?ｇ－’注：Ｒ为极差如表２－４所示，比较各列的极差Ｒ值，可见Ｒ．＞Ｒ。＞Ｒｃ＞Ｒｏ，即在实验所 设定的因素中，豆饼粉对米曲霉产酸性蛋白酶水平的影响因子最大，水的影 响因子最小。比较各列的均值，得到酸性蛋白酶生产最佳因素组合为Ａ：Ｂ正，Ｄ．， 即最适培养基配比（％）为：豆饼粉７．５，（ＮＨ４）ｚＳＯ－０．８，ＫＨｚＰＯ，Ｏ．２５，水４０， 麸皮５１．４５。 ２．３．３．１豆饼粉对轰一２９产酸性蛋白酶的影响 由表２－－４中的数据和分析结果可以发现，因素Ａ（即豆饼粉）的Ｘ值（各水平酶活均值）随豆饼粉的增加，呈现出先增加后减少的现象，也就是说酸性蛋白酶的酶活水平随着培养基中的豆饼粉量的增加呈“钟”型分布，当豆 饼粉量过低或者过高时都会不利于酸性蛋白酶的生产．这说明豆饼粉的过量 会对米曲霉产酸性蛋白酶有抑制作用． ２．３．３．２（ＮＨ４）：ＳＯ．对＾一２９产酸性蛋白酶的影响 微生物发酵培养基中两个最为重要的成分就是碳源和氮源，二者是微生西南交通大学硕士研究生学位论文第２７页物能够正常生长的保障。氮源是指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营 养物质。它是微生物发酵中使用的主要原料之一。其主要功能是构成微生物细胞和含氮的代谢产物，当培养基中氮源不足时，可以补充氮源。常用的氮源有有机氮源和无机氮源两大类。本实验所使用的（ＮＨ．）：ＳＯ．即为工业发酵中 最为常用的无机氮源，由表２―４中我们可以发现（ＮＨ．）：ＳＯ。的浓度在水平２时， 最适合酸性蛋白酶的生产．其原因可能是由于（ＮＨ．）：ＳＯ，浓度过高会使培养基 的ｐＨ值太低，而浓度过低则不能保证菌株正常的氮源需求所致。２．３．３．３ＫＨ：Ｐ０．对Ａ一２９产酸性蛋白酶的影晌当然微生物发酵培养基中除了必需的碳源和氮源外，其他无机盐元素有 很多也是必不可少的，例如现在所讨论的磷酸盐。控制磷酸盐的浓度对于微 生物发酵来说是非常重要的．根据有关文献的报道磷酸盐对蛋白酶的生产很 重要，它具有稳定蛋白酶的功能。磷酸盐在培养基中量的控制，一般是在基 础培养基中采用适当的浓度，其最适浓度取决于菌种的特性、培养条件，培 养基组成和来源等诸多因素。从表２－－４可以看出磷酸盐在０。２５％时，即水 平３时最适合酸性蛋白酶的产生。这一结果也再次证明了，磷酸盐具有稳定 蛋白酶的功能，对蛋白酶的生产十分重要的观点． ２．３．３．３水量对Ａ一２９产酸性蛋白酶的影响固态发酵（ＳＳＦ）的特点就在于，它是在培养基呈固态，虽然含水丰富，但没有或几乎没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程。可 见虽然是固态发酵，但水作为发酵培养基的最主要组成成分的地位与液态发 酵一样，是不容动摇的．因此固态发酵培养基中所含水的量必然会对发酵过 程造成一定的影响，甚至对发酵结果起着重要的作用。这种影响在表２―４中 已经有明显的表现，随着培养基中水量的增加米曲霉的产酶水平是呈逐渐降 低的趋势的，可见该发酵过程过量水的加入将对酸性蛋白酶的生产有一定抑制作用。这也许主要是因为随着水的加入，固态发酵培养基在发酵过程中更容易结块，培养基紧密度的增加。将使米曲霉生长时的透气性降低，对米曲 霉的生长造成了抑制，因而影响产酶能力。２．３．４米曲霉Ａ一２９固态发酵工艺优化２．３．４．１培养时间的影响 本实验分别考察了Ａ一２９在２９℃分别培养２４ｈ～８４ｈ，米曲霉产酸性蛋白 酶的情况，其产酶结果如表２－－５所示．实验结果可以看出（如图２―２），２９ ℃下进行发酵，随着培养时间的增长，酸性蛋白酶的生产呈现直线增加趋势，西南交通大学硕士研究生学位论文第２８页但在７２ｈ达到最大值，最大值为１７３３７．６９ Ｕ／ｇ，超过７２ｈ后，发酵产物的酶 活则逐渐下降，到８４ｈ时酶活己降到了１５６００．７０ Ｕ／ｇ。这主要是由于米曲霉 矗一２９在产酸性蛋白酶的同时，酸性蛋自酶也在失去活性，当发酵所产生的酶 与同时被分解失活的酶量差值最大时，所测酶活将出现最大值，即７２ｈ时． 而当超过７２ｈ后，由于菌体的孢予化程度加强，产酸性蛋白酶能力相应降低，但酸性蛋白酶的分解率没有发生变化，因而其酸性蛋白酶酶活逐渐降低。表２－－５培养时间对＾一２９产酸性蛋白的影响２００００１５０００１００００５０００Ｏ１２ ２４３６４８６０７２８４９６培养时间／ｈ 图２―２酸性蛋白酶酶活与培养时间关系图西南交通大学硕士研究生学位论文 ２．３．４．２培养温度的影响第２９页如图２―３所示，３０℃下培养的产物的酸性蛋白酶酶活最高，高达１７３３７．６９Ｕ／ｇ，２７℃下培养的产物的酶活与３３℃下培养的产物的酶活大致相同。因此，Ａ一２９的最佳培养温度是３０℃．其原因在于，２７℃时，虽然温度 低蛋白酶的失活速率小，但同时菌体的生长性能也受到了抑制。而３３℃时温度又太高，使酸性蛋白酶失活速率加快，其酶活也不会太高。３０℃时菌体孢 子化较慢，且酸性蛋白酶失活速度也相对较缓慢，酸性蛋白酶的酶活就很高．因此菌株在３０℃时出现产酶峰值，呈现出３０℃酸性蛋白酶酶活＞３３℃酸性蛋 白酶酶活＞２７℃酸性蛋白酶酶活。表２－－６培养温度的对＾一２９酸性蛋白的影响１７５００．１７０００∞●＼ｊ５５００妲 避 霜 斗５０００ ５５００２５２６２７２８２９３０３ｌ３２３３３４３５温度／℃ 图２―３酸性蛋白酶酶活与培养时间关系图西南交通大学硕士研究生学位论文第３０页２．４小结利用微生物生产酸性蛋白酶，国内以液体发酵为主，而本实验则通过米曲霉的固态发酵来进行酸性蛋白酶的生产。首先，在两株本实验保藏的产酸 性蛋白酶的米曲霉中选取产酸性蛋白酶活力较高的米曲霉Ａ一２９菌株作为本 实验的发酵工艺研究菌株．然后。以米曲霉Ａ一２９菌株出发，通过正交实验 对该菌株的培养基进行优化，获取米曲霉Ａ一２９菌株固态发酵生产酸性蛋白 酶的最佳发酵培养基。最后，以优化出的产酸性蛋白酶最佳发酵培养基培养 米曲霉Ａ一２９，对酸性蛋白酶发酵生产工艺进行优化。 具体实验结果如下所示： １）从米曲霉Ａ－２９，Ａ一７９中筛选出了生产酸性蛋白酶活力较高的米曲霉 Ａ－２９菌株。 ２）通过正交实验方法，优化得出了米曲霉Ａ一２９菌株产酸性蛋白酶的最 佳发酵培养基（％）为；豆饼粉７．５，（ＮＨ。），ＳＯ；０．８，ＫＨ：Ｐ０４０，２５，水４０，麸 皮５１．４５。３）以优化出的产酸性蛋白酶最佳发酵培养基培养米曲霉Ａ一２９，对酸性蛋白酶固态发酵生产工艺进行优化，得出了如下工艺：①较佳固态发酵时间为：７２小时． ②较佳培养温度：３０℃．４）经最佳发酵培养基以及优化后的固态发酵工艺生产所获酸性蛋白酶的 酶活普遍达到了１７０００Ｕ／ｇ曲．与胡稳奇（１９９５）利用米曲霉Ａ－－９００５生产酸 性蛋白酶，经水浸泡抽提酸性蛋白酶活力达到６０００Ｕ／ｇ比较，本实验室所保 藏的米曲霉菌＾一２９产酸性蛋白酶能力有显著提高。西南交通大学硕士研究生学位论文第３１页第３章新型蛋白饲料固态混合发酵工艺研究传统的蛋白质消化，吸收理论认为，蛋白质在肠道内，在胰蛋白酶和糜蛋白酶作用下生成游离氨基酸和小肽，小肽在肽酶的作用下被完全水解成游 离氨基酸，并以游离氨基酸形式进入血液循环。２０世纪６０年代后，许多学者通过大量试验发现，用纯合日粮或低蛋白氨基酸平衡的日粮饲喂动物并不能 达到最佳生产性能。而Ｎｅｗｅｙ和Ｓｍｉｔｈ（１９６０）则提出了令人信服的小肽可被 完整吸收的论据．Ｈａｒａ等（１９８４）也指出，蛋白质在消化道中的消化终产物的 大部分是小肽，且小肽能完整地通过肠粘膜细胞而进入体循环。小肽吸收理 论极大地丰富了蛋白质营养理论，而且日粮中小肽的添加在动物饲养过程中 可起到促进氨基酸吸收和提高蛋白质沉积、提高蛋白质的合成效率、提高矿 物质的吸收率、增强动物的生产性能以及提高动物免疫力等诸多作用． 酸性蛋白酶作为一种新型的饲料添加剂。其在适宜的酸性条件下。在体 外可以水解饲料中的动物或植物蛋白为小肽及游离的氨基酸，在体内可作为 外源酶协同动物体内蛋白酶类帮助动物对饲料中的蛋白质进行消化吸收．因 此，基于酸性蛋白酶的新型蛋白饲料开发，是新型小肽营养饲料产品开发中 的一条崭新的思路。 本研究将以麸皮和豆饼粉为主要原料，以米曲霉Ａ一２９和酵母菌ＣＨＣ一３、ＤＳＦ－Ｉ、ＧＹ－Ｉ为出发菌株，通过培养基的优化和混合固态发酵工艺的研究，获得一条富含小肽的新型蛋白饲料生产工艺。该工艺不仅清洁环保、节约能源， 而且成本较低、物美价廉，易于在畜牧业中推广应用。３．１材料及仪器 ３．１．１材料和试剂３．１．１．１菌种 酸性蛋白酶生产菌株：米曲霉Ａ－－２９菌株。 微生态酵母菌株：本实验室已研究并保藏的一组协同作用饲料微生态酵 母菌株，包括酵母菌株ＣＨｃ一３、ＤＳＦ＿ｌ、６Ｙ一１。 ３．１．Ｉ．２培养基 酵母菌一级种子培养基：麸皮水５％，液体糖度１０％，豆饼粉１％，硫酸 胺ｌ％．?西南交通大学硕士研究生学位论文第３２页酵母菌二级种子培养基则采用正交实验己获得的最佳培养基；麸皮５％， 液体糖度ｌｌ％，豆饼粉９％，硫酸胺０．８％。 米曲霉Ａ－２９菌株产酸性蛋白酶的最佳发酵培养基（％）为；豆饼粉７．５， （ＮＨ。），ＳＯ。０．８，ＫＨ：ＰＯ，Ｏ．２５，水４０。麸皮５１．４５。?混合固态发酵培养基（％）：麸皮２５，豆饼粉２５，（Ｎ也）：ＳＯ，Ｏ．８，水４９．２ （糖度１０％）。 ３．１．１．３试剂 硫酸（ＧＢ ６２５－７７）：化学纯。（成都科龙化工试剂厂） 硫酸铜（ｃａ ６６５－７８）：化学纯。（汕头市光华化学厂） 硫酸钾（Ｈｅ ３－９２０－７６）：化学纯或硫酸钠（ＨＧ ３－９０８－７６）：化学纯。（汕头市光华化学厂）氢氧化钠（ＧＢ ６２９－７７）：化学纯。４０９溶成ｌＯＯｍｌ配成４０％水溶液（ｗ／ｖ）。 （汕头市光华化学厂） 硼酸（ＧＢ ６２８－７８）：分析纯，２９溶于１００ｍｌ水配成臻溶液（Ｗ／Ｖ）。（汕头 市光华化学厂） 混合指示剂：甲基红（Ｈ６ ３－９５８―７６）０．１％乙醇溶液，溴甲酚绿（ＨＧ ３－１２２０－７９）０．５％乙醇溶液，两溶液等体积混合。 ０．０５Ｎ盐酸标准溶液（邻苯二甲酸氢钾法标定）：４．２ｍｌ盐酸（ＣＢ ６２２―７７）， 分析纯，注入１０００ｍｌ蒸馏水中。 蔗糖（ＨＧ ３－１００１－７６）：分析纯。（汕头市光华化学厂） 硫酸铵（ＧＢ １３９６－７８）：分析纯。（汕头市光华化学厂） 磷酸二氢钾：分析纯。（汕头市光华化学厂） 麸皮、豆饼粉：成都本地市场购买 淀粉水解糖；淀粉于成都本地市场购买，自制水解糖。３．１．２仪器实验室用样品粉碎机或研钵． 分析筛：孔径Ｏ．４５ｎｕｎ（４０目） 分析天平：感量Ｏ．０００１９。 消煮炉或电炉。 滴定管：酸式。２５或ｌＯｍｌ。 凯氏烧瓶：１００或５００ｒａｌ． 凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸汽蒸馏式。西南交通大学硕士研究生学位论文 锥形瓶：１５０或２５０ｍｌ。 容量瓶：１００ｍｌ。第３３页３．２实验方法３．２．１粗蛋白测定方法饲料粗蛋白测定方法（中华人民共和国国家标准，ＧＢ ３．２．１．１方法适用性和原理 本标准适用于配合饲料和单一饲料。 方法原理：应用凯氏定氮法测定试样含氮量．即在催化剂中，用硫酸破６４３２―８６）坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱并蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用酸滴定方法测出样品中氮的含量，乘以氮与蛋白质的换算系数６．２５计 算出粗蛋白的含量。局限性；此法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。 ３．２．１．２测定步骤 １）试样的消煮 称取Ｏ．５．１９试样（含氮量５－８０ｎａｇ）准确至Ｏ．００２９，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜Ｏ．９９，无水硫酸钾（或硫酸钠）１５９，与试样混合均匀，再加硫酸２５ｍｌ和２粒玻璃珠，在消煮炉上小心加热，待样品焦化，泡沫消失， 再加强火力（３６０－４１０＂Ｃ）直至溶液澄清后，再加热至少２ｈ。 ２）氨的蒸馏 将１）步中的试样消煮液冷却，加蒸馏水２０ｍｌ，转入１００ｍｌ容量瓶。冷却 后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。取２０ｍｌ ２％硼酸溶液，加混合指示 剂２滴，使半微量蒸馁装置的冷凝管末端浸入此溶液。蒸馏装置的蒸汽发生 器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则补 加硫酸。准确移取试样分解液１０－２０ｍｌ注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸 馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加１０ｍ１４０％氢氧化钠溶液，小心提 起玻璃塞使之流入反应室中，将玻璃塞塞好，且在入口处加水封好，防止漏 气，蒸馏４ｍｉｎ，使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏ｌｍｉｎ，用蒸馏水洗冷凝 管末端，洗液均流入吸收液。 ３）滴定 吸收氨后的吸收液立即用０．０５Ｎ盐酸标准溶液滴定，将溶液由蓝绿色变．西南交通大学硕士研究生学位论文 为灰红色为终点． ４）空白测定第３４页称取蔗糖Ｏ．１ ｇ’代替试样，按如上方法进行空白测定，消耗０．０５Ｎ盐酸标 准溶液的体积不得超过Ｏ．３ｍｌ。 ３．２．１．３测定结果的计算 ３．２．１．３．１计算公式 计算公式如下： （Ｖ２－Ｖ１）ＸＮＸ０．０１４０ＸＧ．２５ 粗蛋白质（％）＝ＶｌＸ１００Ｗ×一Ｖ式中：Ｖ２－－滴定试样时所需酸标准溶液体积，ｍｌ： Ｖｌ一滴定空自时所需酸标准溶液体积，ｍｌ； Ｎ一盐酸标准溶液当量浓度：Ｗ一试样重量，ｇ：Ｖ―试样分解液总体积，ｍｌ：Ｖ’―试样分解液蒸馏用体积，ｍｌ：０．０１４０－－＝氮的毫克当量数： ６．２５一氮换算成蛋白质的平均系数。３．２．Ｉ．３．２重复性 每个试样取两平行样进行测定，以其算术平均值为结果； 当粗蛋白质含量在２５％以上，允许相对偏差为１％； 当粗蛋白质含量在１０－２５％，允许相对偏差为２％； 当粗蛋白质含量在１０％以下。允许相对偏差为３％。３．２．２酵母菌数的测定方法血球计数板法。ａ．血球计测定酵母细胞数通常应用血球计，血球计为一块具有Ｈ形沟槽的厚玻璃片。Ｈ性内之两端空框均刻有精密网格的计数区域。按计数区精 密网格的不同刻法，有两种形式的血球计：一种希利格式（Ｈｅｌｌｉｇｅ）血球计； 另一种叫汤母氏（Ｔｈｏｍｏｓ）血球计。 两种血球计的小方格尺寸都相同，每一个小方格的边长为ｌ Ｘ ２０毫米，深 度为ｌＸ１０毫米。其体积为ｌ×２０×ｌ×２０×ｌ×１０－－－－４０００立方毫米．ｂ．１０％硫酸溶液 ｃ．０．１％次甲基蓝溶液西南交通大学硕士研究生学位论文第３５页３．２．３小肽分解率的测定小肽制品质量检测分析Ｄ“。采用甲醛滴定法进行产品中氨基氮测定，利 用酪蛋白水解度计算出产品中小肽分解率．３．２．４酸－性蛋白酶活的测定Ｆｏｌｉｎ酚法魄】３．２．５还原糖的测定ＤＮＳ法””３．２．６淀粉水解糖的制备１．将玉米粉配成２５～３０％的淀粉乳，调ｐＨ为６．Ｏ～６．５，加Ｃｒ＋（ＣａＣｉ：）到 浓度为０．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ，按３０ｕ／ｇ淀粉的量，加入耐高温ａ一淀粉酶． ２．液化；将配置的２５～３０％淀粉乳液，在９０～９５℃下，水浴保温２０分钟左右，ＤＥ值达１５％～２０％，或用稀碘液指示剂检测，淀粉乳液由蓝色转变为褐色，表示液化完全，转入糖化阶段。 ３．糖化：将温度降至６０＂Ｃ，调整ｐＨ为４．Ｏ～４．５，按ｌＯＯｕ／ｇ淀粉的量加 入糖化酶，保温６～１０小时，ＤＥ值达９８％，表示糖化完全。 ４．测定：原料中淀粉的含量及糖化液中还原糖的含量西南交通大学硕士研究生学位论文第３６页３．３新型蛋白饲料生产}